一种重组载体及其在制备或筛选抗流感药物中的应用
【专利说明】
[00011 本申请是申请号为2012100197129、发明名称为"抑制流感病毒相关基因的siRNA 及其应用"、申请日为2012年1月20日的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，特别涉及抑制小窝蛋白2和表面活性蛋白D基因表达的 siRNA、siRNA的核苷酸序列、可编码该siRNA的重组载体以及可编码转录因子A和对氧磷酸 酶3的重组载体，以及它们各自的基因在制备和筛选抗流感药物方面的用途。
【背景技术】
[0003] 病毒入侵宿主过程伴随着宿主基因表达变化，最终决定感染细胞和病毒各自的命 运。病毒感染宿主后需要利用宿主细胞的代谢过程完成病毒自身的复制，在这一过程病毒 必然会调控宿主细胞内基因组的表达，抑制抗病毒基因表达，增强对病毒复制有益的基因 表达。因此，病毒感染宿主细胞后，宿主细胞内表达变化的这些基因往往和病毒复制有密切 的关系。通过生物学手段调控宿主细胞内这些基因中一个或同时调控多个基因表达可能具 有抑制流感病毒复制的作用，具有潜在预防和治疗流感病毒感染的应用价值。
[0004] 流感病毒为正粘病毒科流感病毒属分节段单股负链RNA病毒。病毒粒子刚分离时 呈多晶形，在体内传代后变成球形，直径80-120nm(Palese，et al.，2007)。病毒粒子由0.8-1 %的RNA、70-75 %的蛋白质、20 %的脂类和5-8 %的糖类组成，此处比例均为质量比。
[0005] 流感病毒分为A、B、C三型，其中A型（甲型）最为重要。甲型流感病毒能引起人类、 猪、马和各种禽类的自然感染和发病。由于其表面抗原HA和NA容易变异，已知HA有16个亚型 (H1-H16)，NA有9个亚型（N1-N9)，它们之间的不同组合，使甲型流感病毒有许多亚型（如 !1謂1、!12吧、!13吧、!15矶等），在猪体中主要流行!1謂1和!13吧亚型。
[0006] 不同动物有不同的流感病毒，如猪流感、人流感、马流感，一般情况下这些流感只 感染各自的本属动物。但是，流感病毒具有宿主种的适应性。在不同种动物的个体之间也容 易发生传播，形成感染多种动物的新流感病毒。另一个特点是猪这种动物比较特殊，猪对其 它动物的流感病毒也易感，这是其它动物不具有的特性。所以一旦猪同时感染了人流感、猪 流感、禽流感等，这多种病毒会在猪体内发生重组，可能就会出来一种既能感染猪、人、禽的 流感病毒。所以狭义的猪流感不是人兽共患病。流感在人与人之间传播范围很有限，跟流感 的传播途径有关。比如2009年甲型流感，就是人流感、猪流感、禽流感共同感染猪后产生的 新流感病毒，最开始感染的人基本都是接触过或跟猪关系密切的人，随后会有更多人感染 流感病毒。人类发展史上流感病毒的大爆发都给社会经济发展、人的健康带来重大危害。为 预防和治疗流感，各国都投入了大量人力物力，不断研究治疗方法和药物。近年来，从宿主 细胞内寻找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一个热门领域。
[0007] 人类发展史上流感病毒的大爆发都给社会经济发展、人的健康带来重大危害。为 预防和治疗流感，各国都投入了大量人力物力，不断研究治疗方法和药物。近年来，针对宿 主细胞内具有抗病毒功能的基因或蛋白作为靶点研发抗病毒药物是一个热门领域。
[0008]以细胞内功能分子作为抗病毒治疗的靶点具有广谱抗病毒、不易产生耐药毒株的 优势，逐渐成为研究开发抗病毒治疗药物的热点途径。近年来国际高水平论文多次报道在 宿主细胞内信号通路中筛选具有潜在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如，锌指抗病 毒蛋白（Zinc-finger antiviral protein，ZAP)能通过降解特异病毒RNA进而抑制鼠白血 病病毒等多种病毒的复制，被证明是一种重要的抗病毒因子（Chen et al. (2008) Proc.Natl. Acad. Sci.USA. 105,4352-4357)。利用锌指蛋白为载体携带特异的酶阻断T细胞 中的CCR5表达，可促进Τ细胞清除HIV病毒（Holt et al. UOlO^at.BiotechnoUSASg-Sd?) <^3 泛素连接酶 RNF5 定位于线粒体 ，通过泛素化修饰 ΜΙΤΑ( 也称为 STING) 并引起其降解 而负调控病毒感染后I型干扰素表达（Zhong et al.(2009)Immunity.30,397-407)〇 Tetherin(宿主细胞蛋白）以二聚体锚定HIV在其复制的细胞膜上，阻断病毒从胞浆膜出芽 释放（Perez-Caballero et al.UOOWCell.mdgg-SllhAPOBECSGQpolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G)可诱导HIV基因变异，使病毒不 能复制（Shirakawa et al · (2008)Nat · Struct .Mol · Biol · 15，1184-1191)。目前细胞周期素 依赖激酶、前列腺素、热休克蛋白作为药靶分子广泛用于如，1?1^、!11￥、!^￥、腺病毒和乳头 状瘤等病毒病治疗。
[0009] RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能 基因组研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其 序列同源的mRNA，封闭内源性基因表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中 未知基因的功能。早期就有人应用此项技术分离了果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种 成分。近来也有实验报道通过RNAi研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前， 曾利用反义RNA与革巴mRNA序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表 达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，目前已通 过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物Vitravene。
[0010] RNAi特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本 身的调控系统也没有影响。最近在人类体细胞里已经成功地对近20种基因功能进行了"敲 除"，尤其是因此而了解了人类空泡蛋白TsglOl对HIV在人体内增殖的作用，进一步深化了 对HIV的研究。Leonid等以脊髓灰质炎病毒为模型，利用RNAi来诱导细胞的胞内免疫，产生 抗病毒效应，尤其是针对RNA病毒。对于易突变的病毒，可设计多种靶向病毒基因保守序列 的dsRNA，减少它对dsRNA的抵抗。Maen等也应用RNAi技术成功地阻断了MCF-7乳腺癌细胞中 一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因21的功能。RNAi技术的应用，不仅 能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学）的发展，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人 类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物 医学研究等领域，用RNAi技术来抑制基因的异常表达，为治疗各种疾病开辟了新的途径。 [0011]由于近年来分子生物学技术和细胞生物学技术的快速发展，分子药理学研究也不 断深入，新的药物作用靶点、功能蛋白质、基因表达的变化，生物活性成分等不断发现，为药 物筛选提供了大量新的靶点，如新的受体、酶等。这些新的靶点为新药筛选提供了新的信息 和机会。细胞分子水平药物筛选模型的应用为自动化操作奠定了基础，使药物筛选由传统 的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，形成了高通量药 物筛选。
[0012] 高通量药物筛选的优点：实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用了药用物质 资源，提高了药物发现的概率，同时提高了发现新药的质量;筛选实验是在微量筛选系统中 完成的，样品用量一般在微克级(yg)，节省了样品资源，奠定了"一药多筛"的物质基础，同 时节省了实验材料，降低了单药筛选成本;高通量药物筛选为高度自动化操作减少了操作 误差的发生，降低了劳动强度，而且提高了药物筛选的效率和结果的准确性;具有多学科理 论和技术结合的特点。
[0013] 药物筛选模型是发现新药的重要条件。新模型的建立将会带动新型药物的出现。 分子生物学、细胞生物学、计算机科学的发展，特别是人类基因组计划的完成，为医药研究 带来了良好的机遇，也为建立新的药物筛选模型，提供了理论、技术、材料等多方面的优势 条件。因此，我们应充分利用各学科的发展技术建立更多新的筛选模型，促进新药的发现。
[0014] DNA疫苗是上世纪九十年代发展起来的新技术，即将外源基因克隆到真核表达载 体上构建DNA疫苗质粒，DNA疫苗经过各种途径注射到动物基体内后，可被宿主细胞吸收和 摄取，进入宿主细胞的细胞核中转录成mRNA，再在胞浆中翻译成蛋白质。其中一部分蛋白质 在降解后与MHC I类分子结合，并被递呈到细胞表面被CD8T细胞的受体识别，而激活细胞毒 性T细胞的活性；另一部分蛋白质也可以分泌出去，再像外源蛋白一样被抗原提呈细胞摄 取，在吞噬溶酶体内降解成多肽，并进一步与MHC II类分子结合，有抗原提呈细胞提呈到细 胞表面被Th2细胞的受体识别，然后由Th2细胞分泌的细胞因子作用于B细胞，而刺激以抗体 产生为主的体液免疫。DNA疫苗不仅可诱导产生体液免疫，而且可诱导强烈而持久的细胞免 疫，还可避免向外界排毒，而且DNA疫苗与减毒和弱毒疫苗不一样，其不存在毒力反强等问 题。其安全性及高效性是传统疫苗所达不到的，所以，该技术在病毒、细胞内寄生所引起的 传染病、寄生虫以及肿瘤防治中显示出巨大的潜力。Wolff对重组质粒可以在小鼠体内表达 进行了报道，外源蛋白可以在小鼠体内表达长达60天，提示质粒DNA可以在体内相当一段时 间内进行表达，可以用作治疗性作用，并引起了广泛的研究。
[0015] 基因治疗对于癌症、动脉粥样硬化、骨质疏松、关节炎、阿耳茨海默氏病因为特定 基因活动异常而引起的疾病的预防和治疗很有前景。该疗法是一种将核酸引入人细胞以用 来修改它们的遗传特性而达到治疗目的的治疗策略。通常，该核酸是能够编码起治疗作用， 破坏作用或者标记作用的蛋白质的双链DNA分子(dsDNA)。该核酸也可能是与宿主细胞里的 目标序列结合，通过阻止mRNAs或者启动子来抑制特定基因表达的反义RNA或者单链DNA (ssDNA)。至今，以质粒为基础的基因治疗、癌症疫苗等已经超过了600例，质粒DNA的基因免 疫模拟了病原体在细胞内的基因表达途径，已经成功地应用来治疗下肢的局部缺血，心血 管再生，并极有希望通过核酸疫苗来预防现代医学的疑难杂症，包括疟疾、艾滋病、乙肝和 结核病等。对于基因治疗，质粒不能整合入基因组DNA也许是个缺点，但是质粒可以附加体 的形式存在于细胞核中，也可以持续表达相当长的一段时间。
【发明内容】
[0016] 因此，本发明要解决的技术问题就是设计抑制宿主体内和流感病毒复制相关基因 的siRNA序列，构建能够编码该siRNA的重组载体，以及含有该序列开放阅读框的重组载体 在制备抗流感药物方面的应用。
[0017] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种针对小窝蛋白2基因的 s iRNA，其中本发明所述的s iRNA对应的靶序列是小窝蛋白2基因的mRNA，本发明所述的 siRNA的长度为16-30bp，且可使经其转染后的哺乳动物细胞的mRNA或蛋白表达下降60%以 上。
[0018]其中所述的哺乳动物包括选自猪、犬、鼠、人等哺乳动物，本发明中较佳的是猪，本 发明的siRNA在猪中具有较好的沉默基因的效果。
[0019] 本发明中所述的siRNA，长度为16-30bp，更佳地为18-25bp。较佳的，所述的siRNA 含有选自SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，或如序列表中SEQ ID NO: 1表示。更佳地，所述的 siRNA的3 '端含有2个T或含有2个U的延伸结构。
[0020] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是:一种编码所述的抑制小窝蛋 白2表达的s iRNA的重组载体。
[0021] 根据本发明，所述的重组载体采用的载体可以是本领域常规的载体，包括腺病毒 载体，如以5型(Ad5)、2型(Ad2)为基础的各