一种扇贝足丝蛋白体外表达方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物材料领域，特别是一种扇贝足丝蛋白体外表达方法及应用。
【背景技术】
[0002] 浩瀚的海洋是一座巨型生物宝库，包含着成千上万的已知或未知的陆生生物所不 具有的独特的生物资源。许多海洋生物在漫长的进化过程中形成了各种各样的黏附作用以 适应和对抗动态的海洋环境，这在潮间带的生物类群中表现尤为突出。海洋无脊椎动物可 暂时或永久性的吸附于各种生物或物体表面，它们进化出了独特的黏附机制以促进吸附作 用。海洋多毛类Phragmatopoma ca 1 ifornica能够用分泌出的蛋白黏附剂混合海底的贝壳 及沙粒制造保护性的管子。这种黏附剂可以广泛黏附海洋中的多种材料。刺参Holothuria forskali在受到惊吓时可以防御性地排出许多管状物(Cuvierian tubules)，生化鉴定表 明这些管状物所含蛋白质与糖类的比例为3比2,并且所含的不溶性蛋白比例很大。可溶性 的蛋白包括十种富含酸性氨基酸的蛋白，分子量从17到220kD。藤壶直接永久性地黏附于海 洋水下基质表面(船体，采油平台及管道等）。藤壶幼虫的初始黏附是通过氧醌连接将二羟 苯丙氨酸（多巴，Dopa)组装在一起，这也包括海洋贻贝Mytilus spp.的黏附蛋白，而成体的 黏合剂实质上与幼体有很大差别，其中富含丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸。这三组蛋白质中疏水 性和亲水性的残基交替排列，这些基序被认为是在海水中蛋白的装配中起着重要的作用。 海水及淡水贻贝科黏附蛋白与藤壶的黏合蛋白有所不同，因为它所含的氨基酸基序与藤壶 不同（主要以含有大量多酚蛋白成分为特征），贻贝黏附蛋白含有大量的修饰过的3，4_ Dopa，以及对特定氨基酸的化学修饰(羟基化）。目前从紫贻贝M.edulis中已鉴定出至少十 种与黏附作用相关的蛋白，这也反映出了对这种生物黏附结构研究的得心应手，以及其作 为仿生学研究目标的趋势。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种扇贝足丝蛋白体外表达方法及应用，以提供生物仿生 研究思路，为生物材料拓展新的研究方向。
[0004] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种扇贝足丝蛋白体外 表达方法，其特征在于，包括了蛋白的质谱鉴定，具体操作步骤如下：
[0005] 扇贝足丝蛋白的采集:将市售的栉孔扇贝培养在19°C恒温循环海水的条件下，每 隔一天用干净手术刀片对黏附在培养笼中的足丝纤维蛋白进行刮取，进行足丝全蛋白的收 集，收集到的足丝纤维置于-20°c冰箱内保存；
[0006] 扇贝足丝蛋白的粗提取:将收集到的扇贝足丝蛋白干粉在液氮中研磨成粉末，分 装到1.5mL EP管中，加入30yL 5 %醋酸-盐酸胍裂解液，37 °C金属浴抽提足丝蛋白30分钟， 然后于20,000g 4°C高速离心30分钟，取上清，作为扇贝足丝黏附蛋白粗提液；
[0007]蛋白质质谱鉴定:将提取的蛋白质透析浓缩后按照每100yg蛋白质底物加入3.3yg 酶的比例加入lyg/uL的Trypsin，37°C水浴24小时，利用Q-Exactive质谱仪检测消化后得到 的肽段溶液中的肽段信号，以实验室自己建立的栉孔扇贝足转录组数据库为模板，对质谱 检测到的肽段序列进行搜索；
[0008] 体外表达:基于足转录组数据库对应的0RF，进行引物设计，利用PCR技术获得目的 片段，构建其中针对第一段重复序列的体外重组表达系统，DNA测序验证体外重组表达系统 构建成功，之后转化到大肠杆菌宿主菌中进行体外重组表达。
[0009] 其中，足丝蛋白中富含PCGGXC(X为任意氨基酸残基)及CVC片段的多肽序列。
[0010] 其中，重组表达后的蛋白提取方法如下：
[0011] 将菌体超声破碎，之后沉淀用ros洗两次后1M尿素洗两次，将沉淀用20mM Tris-HCl/6M(pH 8.0)尿素溶解，室温结合Nickels Beads(Qiagen)3小时，20mM Tris-HCl/6M尿 素 (pH 8.0)wash，5%HAc/6M尿素 (pH 3.6)洗脱，将洗脱后的样品透析到超纯水中，冷冻干 燥制备蛋白质样品。
[0012] 本发明同时公开了上述扇贝足丝蛋白在医用材料制备领域的应用。
[0013] 本发明亦同时公开了上述扇贝足丝蛋白在纺织材料制备领域的应用。本发明具有 以下有益效果：
[0014] 本发明通过对提取的扇贝足丝纤维蛋白组分进行分析，发现了一种扇贝足丝蛋白 中的关键组分，并利用基因克隆技术从扇贝基因组中获得了该基因重复序列部分的序列， 建立了该基因重复序列片段的体外重组表达，获得了高效的体外重组表达。并对体外重组 表达蛋白进行了分离纯化及性质研究。结果显示该组分具有在溶液中折叠成为折叠片为 主的结构，提示该组分是一种极具开发潜力的海洋生物蛋白材料，在医用材料等多个领域 具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明实施例1中PCR结果的琼脂糖凝胶电泳图。
[0016] 图2为本发明实施例1中蛋白质的重组表达及初步纯化后蛋白质的电泳图，其中条 带1为Marker蛋白；条带2为重组表达的全菌;条带3为纯化后的蛋白。
[0017] 图3为本发明实施例2中重复蛋白序列在不同pH下，在溶液中的构象变化图，其中 黑色线为pH=5时测得结果，灰色线为pH=8时测得结果。
【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。
[0019] 实施例1
[0020] 本发明公开了一种扇贝足丝蛋白体外表达方法，包括了蛋白分析和体外扩增两个 步骤，其中蛋白分析的具体操作步骤如下：
[0021] 扇贝足丝蛋白的采集:将市售的栉孔扇贝培养在19°C恒温循环海水的条件下，每 隔一天用干净手术刀片对黏附在培养笼中的足丝纤维蛋白进行刮取，进行足丝全蛋白的收 集，收集到的蛋白置于-20°C冰箱内保存；
[0022] 扇贝足丝蛋白的粗提取:将收集到的扇贝足丝蛋白干粉在液氮中研磨成粉末，分 装到1.5mL EP管中，加入30uL 5 %醋酸-盐酸胍裂解液，37 °C金属浴抽提足丝蛋白30分钟， 然后于20,000g 4°C高速离心30分钟，取上清，作为扇贝足丝黏附蛋白粗提液；
[0023]蛋白质质谱鉴定:将提取的蛋白质透析浓缩后按照每100ug蛋白质底物加入3.3yg 酶的比例加入lyg/uL的Trypsin，37°C水浴24小时，利用Q-Exactive质谱仪检测消化后得到 的肽段溶液中的肽段信号。以实验室自己建立的栉孔扇贝足转录组数据库为模板，对质谱 检测到的肽段序列进行搜索。在转录组数据库中，获得了一条富含重复序列的蛋白质阳性 鉴定结果。
[0024]其中体外扩增包括了以下步