，不结合非甲胎蛋白和其它球蛋白分子，结合甲胎蛋白的能力是结合非甲胎蛋白Hb的能力的20?80倍，可以成为鉴别甲胎蛋白的试剂，提高检测方法的特异性和灵敏度，简化检测方法，降低成本。
【附图说明】
[0017]图1为本发明核酸适体与甲胎蛋白的结合能力，图1中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为解离常数(Kd)相对值，图中AFP曲线表示核酸适体AFPI与甲胎蛋白的结合曲线，Ap曲线表示核酸适体AFPl与非甲胎蛋白的结合曲线。
【具体实施方式】
[0018]实施I甲胎蛋白特异结合的核酸适体AFPl的制备
构建随机序列寡核苷酸库:人工合成单链DNA序列，构建库容量为I X 15的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为:
5 ’ -GGATCCACCAGCGTCATCAGCA-N25~4o-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3，
所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~6Q和两端固定序列，所述中间随机序列N25~4o为30?40个碱基的随机序列，所述两端固定序列为:5’_GGATCCACCAGCGTCATCAGCA，3 ’ -CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为 PCR 扩增引物结合区
I)将0.5ml (IxlO9微粒)Invitrogen公司的带有活化氨基的微磁珠与I mo I/L甲胎蛋白在偶联缓冲液(20mM磷酸钾盐缓冲液，0.15M NaCl, ImM DTT，pH 5.5)中混合，加入200ul偶联剂溶液[57% 1-ethyl-3- (3-dimethyIaminopropyI) carbodiimide (EDC)],将上述反应置于25 °C条件下轻混24小时。将藕连甲胎蛋白的磁珠用磁珠分离装置和清洗液(PBS，ImM DTT，批H7.3)清洗后，重新悬浮于0.5ml PBS中。
[0019]2)将5nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液(100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH7.6, 2 mM MgC12, 5mM KCl，I mM CaCl2,0.02% Tween 20, I mM DTT)，进行加热处理:90 °C加热1min，置于冰上1min，然后温度放置5min。
[0020]3)将处理好的单链DNA文库与结合有球蛋白的微磁珠孵育后，收集不结合磁珠的液体。
[0021]4)将步骤3)收集的液体与25ul步骤I)得到的甲胎蛋白-磁珠一起在结合缓冲液中37。(:温育3011^11。
[0022]5)用结合缓冲液洗涤温育后的磁珠，然后加入200ul洗脱缓冲液(20 mM Tris-HClPH7.6, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA)，92°C孵育5min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液，进行PCR反应。
[0023]6)PCR反应程序为:94°C预变性5 min; 940C 30s，470C Imin，720C Imin，扩增20个循环;最终延伸反应为72 °C lOmin。
[0024]7)PCR产物为5’端带有生物素标记的双链DNA，将产物与链霉亲和素磁珠混合，25°C孵育30min后，用0.15 mol/L NaOH使双链DNA变性为单链DNA，通过脱盐柱纯化即得到下一轮筛选的单链DNA文库。
[0025]8)使用200pmol步骤7)得到的新单链DNA文库，重复进行步骤2)至步骤8)的筛选程序，共进行15轮筛选。最后克隆并测序第15轮单链DNA文库，得到AFPl核酸序列:ggcatgggaggtgtaatggc cgagcgattc tactaggaca tcgatgacc agtctgcg。
[0026]实施例2以流式分析法检测核酸适体AFPl与甲胎蛋白的结合能力 I)合成5，端带荧光基团FAM标记的甲胎蛋白核酸适体。
[0027]2)使用O nml/L, 5 nml/L, 10 nml/L, 20 nml/L, 50 nml/L, 100 nml/L, 200nml/L浓度梯度的FAM标记的核酸适体连接甲胎蛋白(AFP)的微磁珠来测定甲胎蛋白核酸适体的解离常数(kd)。用200yL结合缓冲液稀释的上述各种浓度核酸适体，加入150 nmol/L连接甲胎蛋白的微磁珠，37 °C温育30min。用结合缓冲液洗涤磁珠后，重新悬浮在250yL结合缓冲液中。设置随机序列的寡核苷酸片段和连接球蛋白(Ap)的微磁珠作为对照。
[0028]3)使用BD公司的流式细胞仪对微珠进行荧光测定，然后用Sigma plot软件作图，计算出所筛选到的核酸适体与甲胎蛋白相互作用的解离常数(kd)相对值，结果如图1所示。
【主权项】
1.一种甲胎蛋白核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列其序列为: ggcatgggag gtgtaatggc cgagcgattc tactaggaca tcgatgacc agtctgcgo2.—种权利要求1中任一所述甲胎蛋白核酸适体的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种: (1)将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物； (2)权利要求1中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架； (3)权利要求1中所述核酸适体改造成的肽核酸； (4)权利要求1中所述核酸适体改造成的锁核酸。3.—种权利要求1或2中所述甲胎蛋白核酸适体或其衍生物在识别、检测甲胎蛋白，或者制备检测甲胎蛋白的试剂盒方面的应用。
【专利摘要】本发明公开具有高特异性和高亲和力的甲胎蛋白核酸适体及其制备方法。甲胎蛋白核酸适体的核苷酸序列为：ggcatgggag？gtgtaatggc？cgagcgattc？tactaggaca？tcgatgacc？agtctgcg，命名为AFP1。甲胎蛋白核酸适体制备方法包括：构建随机序列文库，筛选靶物质-核酸复合物，分离目的寡核苷酸适体，PCR扩增目的寡核苷酸适体，循环筛选出高度特异性适体，甲胎蛋白核酸适体的修饰。制备获得的核酸适体无毒性，分子量小，易于合成与标记，只特异性识别甲胎蛋白，对其他异型球蛋白或其类似物不识别结合，可成为检测甲胎蛋白含量的分子信标。
【IPC分类】G01N33/68, C12N15/115
【公开号】CN105647932
【申请号】
【发明人】徐大鹏
【申请人】徐大鹏
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月25日...