标试纸条的正面检测结果判断示意图；
[0034]图3为金标试纸条对阴性、弱阳性、阳性和无效样品检测结果图；
[0035]图4为含不同浓度孕酮的唾液和尿液样品检测结果。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0037]实施例1一种基于孕酮核酸探针的金标试纸条的制备
[0038](I)胶体金溶液的制备
[0039]将1此0.5M pH为5.9的醋酸缓冲液和1.5yL 1mM的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶液混合后再向其中加入9yL ΙΟΟμΜ核酸适配体溶液，混合均匀后在25°C下反应I小时，得到活化了巯基的核酸适配体溶液。
[0040]向活化了巯基的核酸适配体溶液中加入10yL30?40nm的金纳米粒子溶液，在250C下震荡30分钟，得到核酸适配体修饰的胶体金中间溶液I。
[0041 ]向核酸适配体修饰的胶体金中间溶液I中加入85yL I ΟμΜ dATP溶液，在25 °C下震荡反应15分钟后静置30分钟，再在4°C下静置6小时，得到核酸适配体修饰的胶体金中间溶液2。
[0042]将核酸适配体修饰的胶体金中间溶液2在10000转/分钟条件下离心8分钟，弃去上清液。用10yL 0.0lM pH为7.4的磷酸缓冲液溶解离心得到的沉淀物，得到核酸适配体修饰的胶体金溶液。
[0043](2)目标检测物核酸探针金标垫的制备
[0044]将核酸适配体修饰的胶体金溶液喷涂到玻璃纤维膜上，得到目标检测物核酸探针金标垫；
[0045](3)具有检测线和参照线的硝酸纤维膜的制备
[0046]将50yL100D的生物素修饰的核酸适配体A溶液和270yL 2mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25°C下静置I小时，在向其中加入520yL 0.0lM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体A溶液。
[0047]将50yL 100D的生物素修饰的核酸适配体B溶液和270yL 2mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25°C下静置I小时，在向其中加入520yL 0.0lM pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体B溶液。
[0048]在一块硝酸纤维膜上用浓度为2.5mg/mL的结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体A溶液和浓度为2.5mg/mL的结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体B溶液分别划两条线平行的线，结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体A溶液划线作为检测线(T线)，结合了链霉亲和素的生物素修饰的核酸适配体B溶液划线为参照线(C线)；
[0049](4)金标试纸条的制备
[0050]如图1所示，将样品玻璃纤维膜1、目标检测物的核酸探针金标垫2、划有检测线4和参照线5的硝酸纤维膜3和吸水玻璃纤维膜6五种粘贴物分别依次粘贴到塑料衬板7上;相邻粘贴物之间的重叠部分的长度为2_，得到基于核酸探针的金标试纸条，干燥封装，温度4 °C?25°C条件下保存。
[0051]使用时，将金标试纸条的样品玻璃纤维膜I端插入到待检测的唾液或尿液等样品中，同时设置一空白对照组，等待1min后取出用肉眼观察检测结果。如果膜上的检测线4和参照线5同时显色表明检测结果是有效的；与空白对照组的检测线相比较，如果检测组的检测线颜色变浅表明待检测样品中含有目标物孕酮特异性抗原，显色越浅表明待检测样品中孕酮特异性抗原浓度越高，为阳性结果;如果只有检测线显色而参照线不显色，表明检测结果无效。
[0052]实施例2
[0053]参见图2，其中序号I为样品玻璃纤维膜，长度为18mm;序号2为核酸探针金标垫，长度为4mm;序号3为硝酸纤维膜，长度为20mm;序号6为吸水玻璃纤维膜，长度为18mm，序号4为检测线，宽度为1_，序号5为参照线，宽度为1_。图中箭头表示液体毛细作用方向。
[0054]图2为利用本发明的金标试纸条进行唾液中孕酮检测过程中，检测结果的判断依据示意图。如何通过基于核酸探针的金标试纸条的检测结果对检测样品中目标物的含量进行判断，是检测方法的重要组成部分。具体检测结果判断依据如下所示:
[0055]图2中左一为基于核酸探针的金标试纸条的阴性检测结果示意图，
[0056]图2中左二为基于核酸探针的金标试纸条的弱阳性检测结果示意图，
[0057]图2中右一为基于核酸探针的金标试纸条的阳性检测结果示意图，
[0058]图2中右二为无效的基于核酸探针的金标试纸条检测结果示意图。
[0059]实物结果照片参见图3，从左到右依次对应图2中的阴性、弱阳性、阳性和无效。多次重复实验的结果一致，表明本发明的试纸条检测结果准确可靠。
[0060]分别取含有01^、0.01碰、0.11^、11^和51^的唾液样品和尿液样品，采用本发明的金标试纸条进行检测，检测结果如图4所示，左侧为唾液样品检测结果图，右侧为尿液样品检测结果图，显示两种样品检测结果一样准确。
[0061]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1.一种孕酮的核酸适配体，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0:1所示，其中序列5’端经过巯基修饰。2.—种互补探针A，与权利要求1所述的孕酮的核酸适配体互补配对，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其中序列5’端经过生物素修饰。3.—种互补探针B，与权利要求1所述的孕酮的核酸适配体互补配对，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中序列5’端经过生物素修饰。4.一种检测孕酮的金标试纸条，其特征在于，在塑料衬板上依次搭接样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜，并且硝酸纤维膜上划有检测线和参照线，参照线靠近吸水玻璃纤维膜一端;其中核酸探针金标垫上附着表面经修饰的胶体金，检测线由核酸适配体A溶液划成，参照线由核酸适配体B溶液划成； 所述胶体金的表面经过活化了巯基的权利要求1所述的孕酮的核酸适配体修饰； 核酸适配体A溶液包括结合了链霉亲和素的权利要求2所述的互补探针A; 核酸适配体B溶液包括结合了链霉亲和素的权利要求3所述的互补探针B。5.根据权利要求4所述的金标试纸条，其特征在于，所述胶体金溶液的制备方法如下: 将醋酸缓冲液和TCEP溶液混合，再向其中加入孕酮的核酸适配体，进行巯基活化反应，反应结束后向其中加入金纳米粒子溶液，震荡；再加入dATP，25°C震荡反应后静置30分钟，再在4°C下静置6小时;然后离心，沉淀用磷酸缓冲液溶解既得。6.根据权利要求5所述的金标试纸条，其特征在于，所述醋酸缓冲液浓度为0.5M，pH值6.5，用量IyL;所述TCEP溶液的浓度为1mM，用量1.5yL；所述dATP浓度IΟμΜ，用量85yL；所述金纳米粒子粒径30?40nm，用量10yL;所述磷酸缓冲液浓度0.01M，pH值7.4，用量520yL。7.根据权利要求4所述的金标试纸条，其特征在于，所述互补探针A溶液制备方法为:将40?80yL I?100D值的生物素修饰的互补探针A溶液和200?300yL I?5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25°C下静置I小时，在向其中加入500?600yL 0.001?1.0OOMpH值6.0?8.0的磷酸盐缓冲溶液。8.根据权利要求4所述的金标试纸条，其特征在于，所述互补探针B溶液制备方法为:将40?80yL I?100D值的生物素修饰的互补探针B溶液和200?300yL I?5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25°C下静置I小时，在向其中加入500?600yL 0.001?1.0OOMpH值6.0?8.0的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的互补探针B溶液。9.权利要求4?8任一所述的金标试纸条的制备方法，其特征在于，将样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜依次粘贴到塑料衬板上，相邻两粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，干燥封装，在4°C?25°C条件下保存。
【专利摘要】本发明公开了一种基于唾液中的孕酮的核酸适配体及检测用金标试纸条，其中孕酮的核酸适配体序列5’端经过巯基修饰，互补探针A序列5’端经过生物素修饰，互补探针B序列5’端经过生物素修饰。本发明的检测孕酮的金标试纸条是在塑料衬板上依次搭接样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜，并且硝酸纤维膜上划有检测线和参照线，参照线靠近吸水玻璃纤维膜一端；其中核酸探针金标垫上附着表面经核酸适配体修饰的胶体金，检测线由核酸适配体A溶液划成，参照线由核酸适配体B溶液划成。本发明无需其他辅助仪器设备，10～15分钟内即可完成检测，结果准确可靠；灵敏度和特异性高，稳定性好，成本低廉，应用范围广。
【IPC分类】C12N15/115, G01N33/531, G01N33/74
【公开号】CN105647930
【申请号】
【发明人】彭杉
【申请人】武汉慧禹信息科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月21日