分析。
[0039]miRNA转录起始位点多位于基因间隔区、内含子以及编码序列的反向互补序列上，其前体具有标志性的发夹结构，成熟体的形成是由Dicer酶的剪切实现的。针对miRNA的生物特征，对于比对到参考基因组上的序列，利用miRDeep2软件进行已知及新的miRNA鉴定。由于不同物种在各个长度中miRNA所占百分比也有差异，故我们以长度为条件进行分类统
i+o
[0040]前体miRNA(pre-miRNAs)在Expo;rtin-5帮助下转运到细胞核外，由细胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs，酶切位点的特异性使得miRNA成熟体序列首位碱基对于碱基U具有很强的偏向性，另外其他的位点也有一些统计，如:2?4号位一般缺少U，第10号位偏向于A (第1号位一般是miRNA对其靶基因发生剪切作用时的剪切位点)。
[0041]对于miRNA其前体序列能够形成发夹结构是其最具标志性特征之一。通过截取一定长度sRNA能够比对在基因组上的序列，利用miRDeep2软件对一定长度的序列其二级结构、分析Dicer酶切位点和计算自由能，如果能够满足miRNA的要求，贝Ij为马铃薯中候选的新miRNA。具体应符标准为:(I)截取的一定长度的序列能够折叠成一个发夹结构的二级结构；(2) miRNA的成熟序列应在发夹结构的一条臂上；(3) miRNAs成熟序列与另一个臂上的miRNA*序列的错配应小于6个碱基；(4) miRNAs成熟序列和miRNA*序列不能形成环状结构或发生断裂；(5) 二级结构有较低的MFEs值和较高的MFEIs值，且A+U的含量应高与C+G的含量。
[0042]通过RNA合成技术，例如MALD1-TOF(matrix-assisted laser desorpt1n1n izati on-time-off light)合成，并通过HPLC对产物RNA进行纯度分析，即能得到所述stu_miR8045产品。
[0043]实施例三:stu-miR8045的应用
l、miRNA靶基因预测
利用stu_miR8045和马铃薯基因mRNA序列信息文件，通过TargetFinder软件进行革巴基因预测。miRNA靶基因预测规则为:
(1)sRNA与靶基因间的错配不得超过4个(G-U配对认为0.5个错配)；
(2)在miRNA/靶基因复合体中，不得有超过2处发生相邻位点的错配；
(3)在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5'端起第2?12个位点不得有相邻位点都发生错配；
(4)miRNA/靶基因复合体的第10?11个位点不得发生错配；
(5)在miRNA/靶基因复合体中，从mi端起第I?12个位点不得有超过2.5个错配
，
(6)miRNA/靶基因复合体的最低自由能(MFE)应不小于该miRNA与其最佳互补体结合时MFE的75% 。
[0044]2、采用RLM-5' RACE验证stu_miR8045的靶基因
(1)5'端接头的连接
RLM-57 RACE反应使用Invitrogen公司的GeneRaeer试剂盒进行。首先用T4 RNA连接酶将一段 RNA 接头序列(GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUG
AAA)直接连接在10ng的总RNA 57末端，在冰上配制反应液，充分混匀，短暂离心，然后37°C孵化I小时，用于反转录合成cDNA。接头反应体系为:总RNA 2yL,5/RACE Adapter I μL,10 XRNA Ligase buffer I yL，T4 RNA Ligase(2.5U/yL) 2 yL,NucIease-free Wate 4yL0
[0045](2)反转录合成cDNA第一链
取已连接5'端接头的反应液2yL进行反转录，反转录反应体系为:Ligated RNA 2 yL,dNTP Mix 4 yL,Random Decamers 2 yL,1X RT Buffer 2 yL,RNase Inhibitor I yL，M_MLV Reverse Transcriptase I yL,NucIease-free Water To 20 yL。
[0046]充分混匀，短暂离心，然后42°C孵化I小时，获得的反转录产物用于巢式PCR扩增反应。
[0047](3)巢式PCR反应扩增
以上一步反转录的产物作为模版，利用靶基因特异的外部引物和接头的外部引物进行5 ' R A C E巢式P C R的第一步反应，基因外部引物和接头的外部引物为:ACGAGCCATAGCAAGTGCTCC和CTCATCCATGTGGAGAGTTGTTGA (Pto-responsive gene Iprotein (PGSC0003DMT400040461))；
CAGACAACTCAACCAGGAGAATGC 和 AGAGAAGTCAGTCTGCTGTCCAGC (泛素结合酶(PGSC0003DMT400017858))。
[0048]反应液在冰上配制，反应体系为:RTreact1n (from the prev1us step) I μL,10X PCR Buffer 5 yL，dNTP Mix 4 yL,57 RACE gene-specific outer primer (10 μM) 2 yL,57 RACE Outer Primer 2 yL,NucIease-free Water To 50 yL，thermostableDNA polymerase (0.25 yL of 5U/yL) 1.25U 反应程序为:
预变性:94 0C 3min；
扩增:94 °C 30 s，60 °C 30 sec，72 °C 30 sec(35次循环)；
延伸:72°C 7 min。
[0049]利用巢式PCR第一步反应的产物作为模板，以靶基因特异的内部引物和接头的内部引物进行巢式PCR的第二步反应，基因内部引物和接头的内部引物为
ACGAGCCATAGCAAGTGCTCC和CTCATCCATGTGGAGAGTTGTTGA (Pto-responsive gene Iprotein (PGSC0003DMT400040461))；
CAGACAACTCAACCAGGAGAATGC 和 AGAGAAGTCAGTCTGCTGTCCAGC (泛素结合酶(PGSC0003DMT400017858))。
[0050]反应体系为:0uterPCR (from the prev1us step) 2 yL，10X PCR Buffer 5 μL,dNTP Mix 4 yL,57 RACE gene-specific innter primer (10 μΜ) 2 yL,57 RACEinner Primer 2 yL,NucIease-free Water To 50 yL，thermostable DNA polymerase(0.25 yL of 5 U/yL) 1.25U。反应程序与巢式PCR第一步反应相同。
[0051 ] (4)目的片段与T载体的连接
扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图2所示，切下目的片段用天根生化公司的柱式DNA胶回收试剂盒回收，纯化回收的具体方法严格按照说明书操作。回收产物连接到pMD?18-T Vector，连接反应体系:pMD? 18-T Vector IyL,Solut1n I 4 yL，回收片段 4 yL，CldH2O I yL
(5 )连接产物的转化及测序
将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，每个靶基因选取至10个阳性克隆采用Solexa高通量测序技术进行测序，测序的结果如附图3所示(箭头所指位置为miRNA降解靶基因的断裂位置)。
[0052]结合附图3和附图4的结果说明，stu-miR8045能够将靶基因泛素结合酶(PGSC0003DMT400017858) mRNA特异性断裂，从而使靶基因表达下调，进而能够研究靶基因功能。
[0053]3、干旱胁迫下stu_miR8045表达量的分析
分别将不同干旱处理阶段的RNA反转录合成cDNA。用SYBR ? Premix Ex TaqII ?荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒检测靶基因在不同干旱处理阶段的表达情况，以延伸因子(efla)基因作为内参，反应体系如下:SYBR ? Premix Ex TaqTM II(2X) 10 yL，qGUS_l(10 μΜ)
0.8 yL,qGUS-2(10 μΜ)0.8 yL，R0X Reference Dye II(50X) 0.4 yL，RT反应液 I yL，CldH2O 7 yLo
[0054]qRT-PCR反应条件为:
95°C预变性10 min 95°C变性 15 sec
60 °C I min 40个循环72 °C 30 sec
计算公式:应用公式RQ(相对表达量)=2—计算在处理前后的相对表达量，Δ ACt=(ACt处理样品一ACt efla) — ( ACt对照样品一ACt efla)。引物序列为:CGCACUGAUAGUUGAGGUGUGUUU 和Un1-miR qPCR PrimerCTaKaRa RR717)。
[0055]如附图4所示，在干旱胁迫处理后马铃薯的两个品种大西洋和紫花白的stu-miR8045基因均表现出显著上调，这表明stu-miR8045的表达受到干旱胁迫调控。因此，在马铃薯中过表达stu-miR8045基因，或者抑制stu-miR8045表达将会培育出具有高抗旱能力的马铃薯转基因品种。
[0056]以上所述仅是本申请的【具体实施方式】，仅作为本发明可实施的技术方案提出；应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以对实验步骤做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
【主权项】
1.马铃薯stu-miR8045，其特征在于所述stu-miR8045的前体序列如序列表SEQID NO:I所示。2.根据权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045，其特征在于所述stu-miR8045的二级结构为:自5’端lbp_20bp和31bp_50bp形成碱基配对，自5’端20bp_31bp形成环状结构的莖环结构。3.根据权利要求1所述的马铃薯stu_miR8045，其特征在于编码所述stu_miR8045前体序列的DNA序列如序列表SEQ ID NO:2所不。4.根据权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045，其特征在于所述stu-miR8045的成熟序列如序列表SEQ ID N0:3所示。5.根据权利要求4所述的马铃薯stu-miR8045，其特征在于所述stu-miR8045的成熟序列是前体序列自5'端57bp-77bp的一段RNA序列。6.权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045在研究革El基因功能中应用。7.根据权利要求6所述的马铃薯stu-miR8045在研究靶基因功能中应用，其特征在于所述革巴基因为Pto-responsive gene I protein和泛素结合酶；Pto-responsive gene Iprotein基因序列如序列表SEQ ID N0:4所示，泛素结合酶基因序列如序列表SEQ ID NO:5所示。8.根据权利要求6所述的马铃薯stu-miR8045在研究靶基因功能中应用，其特征在于所述stu-miR8045通过特异性降解靶基因，使靶基因表达下调而研究靶基因功能。9.权利要求1所述的马铃薯stu-miR8045在培育抗旱转基因植物中的应用。10.根据权利要求9所述的马铃薯stu-miR8045在培育抗旱转基因植物中的应用，其特征在于所述转基因植物为马铃薯。
【专利摘要】本发明提供了一种马铃薯stu-miR8045及其应用。RLM-5′RACE测检结果表明stu-miR8045调控泛素结合酶（PGSC0003DMT400017858）的表达，可用于研究该泛素结合酶基因的功能，即通过缺失表达或过表达该泛素结合酶基因时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR8045的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/113, C12Q1/68
【公开号】CN105647926
【申请号】
【发明人】唐勋, 司怀军, 杨江伟, 王丽, 张宁
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月6日