一种水稻花药强表达启动子OsAnth4及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 花药强表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在花药中强表 达，从而改良作物育性。
【背景技术】
[0002] 启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，调控基因在不同发育阶段及组织中 表达。启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件 的种类、数目及相对位置等共同决定。深入研究这些启动子不仅有助于阐明植物形态、发 育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。
[0003] 根据启动子的转录模式及功能，可将其分为三类:组成型启动子、组织或器官特异 性启动子和诱导型启动子。目前，在植物基因工程中使用的大多数为组成型启动子，使外源 目的基因在植物各组织部位高水平表达，但是，在此过程中会出现多种多样的问题，例如不 能从时间和空间上有效的调控目的基因的表达，过度消耗细胞内的物质和能量;大量异源 蛋白或代谢产物在植物体内积累，打破植物的代谢平衡，不利于植物生长；引起基因沉默或 共抑制现象;此外还存在转基因植物安全性隐忧。因此，科学家们不断寻找更为有效的组织 或器官特异性启动子来代替组成型启动子，以期更精确的调控外源基因的表达。
[0004] 组织特异型启动子仅在特定的组织器官或细胞类型中具有驱动能力，其活性可能 受发育信号的影响。在基因工程中，组织特异型启动子控制了所驱动基因表达产物在特定 器官或组织中积累，限定了目的基因的作用范围，避免了非必要组织中范式表达造成的物 质能量浪费，特别适用于有组织针对性的遗传改良和生物反应器的应用。
[0005] 花药特异性表达启动子与育性的研究密切相关。因此，目前研究人员经常采用花 药特异启动子来进行雄性不育系的培育。优良的雄性不育系在杂种优势的利用上起着重要 的作用。从分子水平上揭示花药花粉基因特异表达调控的机理，越来越受到重视，因此开发 和利用新的植物花药花粉特异表达启动子具有重要的理论及实际意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种驱动目的基因在水稻花药强表达的启动子，获得含有该 启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的"作物"是指禾谷类作物， 例如水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦等，优选为水稻。
[0007] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻花药强表达启动子，所述水稻花 药强表达启动子0sAnth4包含下述序列之一或者下述序列的互补序列之一：
[0008] (a)序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0009] (b)序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
[0010] (c)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获 得的核苷酸序列；
[0011] (d)在序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获 得的核苷酸序列；
[0012] (e)与序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序 列；
[0013] ⑴与序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序 列；
[0014] (g)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获 得的核苷酸序列；
[0015] (h)在序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获 得的核苷酸序列；
[0016] (i)序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的 核苷酸序列；
[0017] (j)序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的 核苷酸序列；
[0018] (k)与带有序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应 产物的对应核苷酸序列；
[0019] (1)与带有序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应 产物的对应核苷酸序列。
[0020] 优选地，所述水稻花药强表达启动子由序列表中SEQ ID No: 1或2所示的DNA序列 构成。
[0021 ] 序列表中SEQ ID No: 1或2所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv. Nipponbare)的序列，本文中称为0sAnth4或启动子0sAnth4。具体而言，本申请的发明人 从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1 或2所示的DNA序列，并且发现该DNA序列具有驱动目标基因在水稻花药特异性强表达的作 用。
[0022] 需要说明的是：序列表中SEQ ID No:l所示的DNA序列与序列表中SEQ ID No:2所 示的DNA序列相比，序列开头多出22bp，即"acaatcgttc tcaaacactg eg"其为获得启动子过 程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾多出22bp，即"tetegatett cttggatggc at"，其 为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互 补）；序列表中SEQ ID N〇:2所示的DNA序列为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是， 本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的 DNA序列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落 入本发明的保护范围之内。
[0023] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻花药强表达启动子的表达盒。
[0024] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻 花药强表达启动子。在所述重组表达载体中，所述水稻花药强表达启动子连接于待表达的 基因序列的上游，待表达基因可以为任何对水稻的花药性状具有改善能力的基因，通过本 发明的启动子驱动该基因在花药中特异性地集中表达，从而实现改善水稻花药相应性状的 功能;优选地，所述待表达的基因为Gus基因。
[0025] 又一方面，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-〇sAnth4,该重组表达载体为将SEQ ID No:l所示的序列即0sAnth4或启动子0sAnth4构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载 体，本文中称为 pCAMBIAl 391 -0sAnth4。
[0026] 另一方面，本发明还提供一种利用所述的水稻花药强表达启动子0sAnth4获得相 应宿主菌的方法，所述方法包括将所述的水稻花药特异表达启动子0sAnth4、所述的表达盒 或者所述的重组表达载体，利用冻融法转入根癌农杆菌。
[0027]另一方面，本发明提供一种利用所述的水稻花药强表达启动子0sAnth4获得相应 转化子的方法，所述方法包括将上面所获得的宿主菌通过农杆菌介导方法对目标细胞、愈 伤组织或植株进行转化，获得相应转化子。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组 织或植株。
[0028] 再一方面，本发明提供上述水稻花药强表达启动子在培育转基因作物中的应用。 所述应用包括将本发明提供的上述水稻花药强表达启动子连接于载体中待表达的基因序 列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所 述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育，进而获得相应转基因植株，优选 地，所述待表达的基因为结构基因、调苄基因、结构基因的反义基因或者能够干扰内源基因 表达的小RNA。
[0029] 另一方面，本发明提供一种在植物的花药中驱动特定目的基因表达的方法，其特 征在于，所述方法包括：
[0030] A)、将所述的水稻花药强表达启动子0sAnth4连接于目的基因的上游；
[0031] B)、将所述水稻花药强表达启动子0sAnth4与目的基因的结合产物转入到根癌农 杆囷中；
[0032] C)、利用转入了所述结合产物的根癌农杆菌对目标植物的种子进行农杆菌转化；
[0033] D)、利用转化后的种子培育相应植株，在所述植株中，权利要求1中所述的水稻花 药强表达启动子0sAnth4能够驱动目的基因表达。
[0034]综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段具有转录调控活性的DNA序列，并将其命名为0sAnth4(序列表中的 SEQ ID N〇:l或2)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在花药中特异性强表达的能 力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表 达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌 农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获 得的转基因水稻进行组织化学检测发现，GUS强烈着色于花粉和花药壁上，在颖壳和花丝基 部有不显著染色，从而证明该序列具有驱动基因特异的在花药中强表达的活性。
[0035]本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的目标基因连接，构建重组表达载体，经转化后，可在花药 特异的驱动目标基因的表达。
[0036]技术效果
[0037]本发明所克隆的水稻启动子0sAnth4能够调控基因在植株花药中集中表达，具有 重要的理论及实际意义。通过该启动子对农作物的育性进行基因改造，获取优质的雄性不 育系，用于作物杂交育种。为揭示花粉花药发育机理的分子水平研究提供实验材料。
【附图说明】
[0038]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0039] 图1为将0sAnth4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为 PCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-〇sAnth4示意图，其中示出了利用0sAnth4启动子驱 动位于其下游的GUS基因表达；
[0040]图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
[00411图3为10周龄0sAnth4-GUS转基因植物各组织⑶S染色图。（A)根；（B)茎；（C)成熟叶 片；（D)小花；（E)雄蕊；（F)花药。标尺为lmm0
【具体实施方式】
[0042]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0043]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生 化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0044]含有酶切位点的0sAnth4启动子的获得
[0045] 步骤1、引物的设计
[0046] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻0sAnth4基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0047] 本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIAl 391 (图1中A部分，来自于CAMBIA，公开 使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存） 为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为:正向引物(SEQ ID No: 3)5 '端带Hi