物)后，加入1毫升75%乙醇(无菌灭毒后DEPC处理水配制)震荡 洗涤，并7500g离心4度5分钟，去上清。e，去上清后，室温干燥RNA 20-30分钟，30μ1 ddH20 (DEPC处理及高温后无核酸酶水)溶解RNA并一 20度保存。
[0077] 提取RNA样本后通过测定浓度和0D 260/280的比值，控制样本质量，最终加入反转 录反应体系中的样本，0D 260/280比值在1.8-2.0之间的可获得最优反应结果。
[0078] 2、反转录反应(同前表2,反应体系总体积为25μ1)
[0079]
[0080] 以上体系混匀后，瞬时离心，70°C放置lOmin，冰育2min，再加入以下试剂进行反转 录(RT)反应，RT 反应程序:42°C60min，70°C10min。
[00811 3、荧光定量qPCR反应(同前表3，qPCR反应体系总体积为20μ1)
[0082]
[0083]
[0084] 荧光定量qPCR反应及溶解曲线条件程序
[0085] a，95°C，20sec;
[0086] b，95°C，lOsec;
[0087] c，60°C，34sec;
[0088] d，重复第b步到第c步骤40个循环；
[0089] e，95°C，15sec;
[0090] f，60°C，60sec;
[0091] g，95°C，15sec;
[0092] h,60°C ，15sec〇
[0093] qPCR反应结果：
[0094] 采用本实施例的肝癌血清miRNA检测试剂盒进行miR-29a-3p、miR-192-5p和内参 线虫cel-miR-39的检测，对应引物扩增特异性较好，均为单峰。图1为检测样本miR-29a-3p 的熔解曲线图；图2为检测样本miR-192-5p的熔解曲线图；图3为检测样本内参cel-miR-39 的熔解曲线图。
[0095] 4、试剂盒的判断标准
[0096] 通过Logistic回归方程拟合miR-29a-3p、miR-192_5p两个指标并联合肝癌巴塞罗 那分期(BCLC stage)构建肝癌患者生存预后风险模型发现，拟合后预后风险模型的灵敏度 和特异性均高于单独指标。通过数据分析，得到该预后风险模型公式，即回归方程为：
[0097] Y = PI〇S = 2 · 19*AbCLC stage+1 · 45*BmiR-192-5p+l · 81*CmiR-29a-3p ;
[0098] PI，即prognostic index;OS，BP〇verall survival;
[0099] ABac stage取值0或1，0代表为早期，1代表为晚期；
[0100] BmiR-192-5p取值0或1，0代表miR-192-5p为低表达，表达量2-^、2.24;1代表其为高 表达，表达量2-m gt2 2.24;
[0101 ] CmiR-29a-3p取值0或1，0代表miR-29a-3p为低表达，表达量2-m gt〈1.37; 1代表其为高 表达，表达量1.37.
[0102]当Y值〈1.81时为患者生存风险低危，Y值>1.81时，患者为生存风险中高危。
[0103] 应用例1
[0104] 采用实施例1的肝癌血清miRNA检测试剂盒，对100例肝癌病人及70例健康人（对 照)血清中的miRNA进行检测，检测miR-192-5p和miR-29a-3p的表达量(2-mgt)值。对检测结 果，采用统计软件SPSS 17.0及MedCalcl2.2.1进行统计分析，miR-192-5p和miR-29a-3p各 单个指标预测结果，及miR-192-5p、miR-29a-3p和巴塞罗那分期(BCLC stage)三者联合构 建风险模型的联合预测结果参见图4,5及表4,5。图5是应用本发明（发现）的预后风险模型， 可以很好地将一大组(群)肝癌患者，细分(分层)为低危险组，中度危险组，高度危险组，分 别对应三条生存曲线，并且经生存分析Kaplan-Meier法，即Kaplan-Meier curves of overal 1 survival (OS)，及Log-rank检验，三者差异显著(P值均小于0.05)，从而指导临床 医生为危险度不同的肝癌患者制订个体化的治疗方案。
[0105]表4各个变量预测生存风险的R0C曲线下面积
[0106]
[0108]
[0107] 表5各个变量预测生存风险的ROC曲线下面积两两比较结果
[0109]
[0110] 如表4,5所示，1^1?-192-5口、1^1?-293-3口和巴塞罗那分期（80^：8七386)三者联合构 建风险模型PI QS的联合预测结果具有R0C曲线下最大面积0.83,并且显著高于其他任何单一 指标的曲线下面积(P值均小于0.01)，说明miR-192-5p、miR-29a-3p和巴塞罗那分期(BCLC stage)三者联合构建风险模型PIos预测肝癌患者生存风险优势明显。
[0111]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的 实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发 明的精神所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种肝癌预后标记物，其特征是：所述预后肝癌标记物为miR-29a-3p和miR-192-5p 的组合，所述miR-29a-3p序列信息如SEQ ID N0.1所示；miR-192-5p序列信息如SEQ ID NO. 2所示。2. 如权利要求1所述的肝癌预后标记物，其特征是，基于所述标记物的预后风险模型公 式为： Y一 2 · 19*AbCLC stage+1 · 45*BmiR-192-5p+l · 81*CmiR-29a-3p ; ABCLC stage取值0或1，0代表为早期，1代表为晚期； BmiR-192-5p取值0或1，0代表miR-192-5p为低表达，表达量2_M eT〈2.24; 1代表其为高表达， 表达量2-mgt2 2.24; CmiR-29a-3p取值0或1，0代表miR-29a-3p为低表达，表达量1.37; 1代表其为高表达， 表达量2^^ 2 1.37; 当Y值〈1.81时为患者生存风险低危，Y值>1.81时，患者为生存风险中高危。3. 权利要求1或2所述miR-29a-3p和miR-192-5p的组合的应用，包括： 在作为评估肝癌预后危险度的分子标记物的应用;或者 在制备用于评估肝癌预后危险度的肝癌血清miRNA检测试剂盒的应用。4. 一种用于评估肝癌预后危险度的肝癌血清miRNA检测试剂盒，其特征是:包括用于配 制反转录反应体系的试剂、用于配制qPCR反应体系的试剂和用于配制内参体系的试剂；其 中，用于配制反转录反应体系的试剂至少包括分别针对miR-29a-3p、miR-192-5p和线虫 cel-miR-39的特异性茎环法反转录引物液；用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括分别针 对miR-29a-3p、miR-192-5p和线虫cel-miR-39的正向引物液和反向通用引物液；用于配制 内参体系的试剂包括内参cel-miR-39液，cel-miR-39的序列信息如SEQIDN0.3所示。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征是:所述用于配制反转录反应体系的试剂还包括 反转录酶液、dNTP混合液、核糖核酸酶抑制剂液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。6. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征是:所述反转录反应体系的总体积为25μ1;其中， 总RNA样品2μ1、特异性茎环法反转录引物液2μ1、反转录酶液0.5μ1、dNTP混合液2μ1、核糖核 酸酶抑制剂液〇 . 5μ1、反转录缓冲液5μ1和无核酸酶纯水13μ1;所述总RNA样品中含有内参 cel_miR-3&^^〇7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征是:所述总RNA样品的制备，是在抽提250μ1血清 总RNA过程中加入的体积为2μ1的内参cel-miR-39液，所述内参cel-miR-39液使用浓度为 0 · 05ρηιο1/μ1 〇8. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征是：用于配制qPCR反应体系的试剂还包括SYBR Green混合液、ROX Reference Dye II液和纯水。9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征是:所述qPCR反应体系的总体积为20μ1;其中，所 述SYBR Green混合液的体积是9μ1，所述正向引物液的体积是0.8μ1，所述反向通用引物液 的体积是〇.8μ1，所述ROX Reference Dye II液0.4yl，cDNA模板是4μ1，其余是纯水;所述正 向引物液的使用浓度为5μΜ，所述反向通用引物液的使用浓度为5μΜ;所述cDNA模板是所述 反转录反应体系反应后的产物。10. 权利要求4~9中任一项所述的试剂盒在评估肝癌预后危险度中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种与肝癌预后相关的血清miRNA标志物及其检测试剂盒的应用。该肿瘤标志物为人类肝癌患者相关的血清miR-29a-3p和miR-192-5p。本发明前期工作经过高通量深度测序，筛选出了包含miR-29a-3p和miR-192-5p在内的表达差异明显的肝癌相关血清miRNA表达谱，并且经定量PCR(qPCR)验证，最终确认血清miR-29a-3p和miR-192-5p是肝癌危险度(预后)相关的肿瘤标志物。本发明的标志物和检测试剂可用于制备快速检测定量PCR试剂盒，具有检测快速方便，准确率高、无创伤等特点；并且miR-29a-3p、miR-192-5p及肝癌巴塞罗那分期(BCLC？stage)三者联合构建的预后模型，可用于肝癌患者危险度高低的分级分层，从而指导肝癌病人个体化治疗。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113
【公开号】CN105647923
【申请号】
【发明人】邵建永, 朱浩图
【申请人】中山大学附属肿瘤医院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月29日