一种用于靶向杂交捕获的修饰性dna杂交探针的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂 交探针的制备方法。
【背景技术】
[0002] 2003年，〃人类基因组计划〃获得首张人类全基因组图谱，这一成果引领开辟了基 因组学分析、个体化医疗。伴随着人类技术的革新，二代测序技术（Next Generation Sequencing)出现在人们的视野，它可以一次性完成数十万到数百万条DNA分子的序列测 定，使得在极短时间内对基因组进行细致研究成为可能。大量研究表明，人类疾病特别是癌 症的产生与其个体相关基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP) 有着显著的相关性。尽管与传统测序技术相比，下一代测序技术的成本大幅降低，但目前测 序一套个人基因组图谱仍然高达数万人民币，而由于受到测序深度的限制，几乎无法提供 指标意义判读的数据。所以，在现阶段，如何实现对大批量样本的某个特定区域进行高通量 平行靶向样本制备并测序，确定和了解涉及人类疾病的遗传变异，提高诊断、治疗和预防疾 病的能力，对许多科学和临床医学研究具有重大意义。
[0003] 靶向测序文库制备技术充分发挥了二代测序技术的潜能，与全基因组测序相比， 富集后再测序大大降低了成本，减轻了后续数据分析的压力，让研究人员能够充分利用二 代测序的通量。由于存在着非常高的技术壁皇，目前几种靶向富集方法主要包括以基于 RNA:DNA核酸杂交层面上的靶向序列捕获系统。其中基于微阵列芯片上合成制备寡核甘酸 池，然后再进一步体外制备RNA探针，虽然在探针制备上具有极强的灵活性，但是RNA杂交捕 获探针不具有稳定性，需要严格的储藏与运输条件。同时由于所用的所使用的探针为RNA， 需要极高的操作要求、试剂以及实验器皿都需要是无 RNA酶的。对于实验操作人员的技术要 求性极高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方 法，无需RNA探针对于环境和操作的严格要求，又保留了 RNA:DNA核酸分子极强结合能力的 性能。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006] -种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)通过平行制备寡核苷酸池获得包含目标序列以及通用引物区域的DNA模板；
[0008] (2)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物进行PCR反应，同时在PCR过程中引入 生物素标记的ATP和甲基化dm 5CTP;
[0009] (3)磁珠富集法纯化PCR产物；
[0010] (4)对纯化后的PCR产物进行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化；
[0011] (5)磁珠富集法纯化步骤(4)处理后的产物；
[0012] (6)Lambda核酸外切酶水解步骤(5)纯化后产物的双链DNA中一条带有5'端磷酸化 的单链，从而获得带有生物素标记的单链DNA;
[0013] (7)磁珠富集法纯化带有生物素标记的单链DNA，得修饰性DNA杂交探针。
[0014] 本发明创造性的点在于步骤2、4、6,以往利用平行制备寡核苷酸池进行捕获探针 制备，其主要方法为使用Taq酶将平行制备的寡核苷酸池进行PCR扩增，同时在PCR引物端引 入T7启动子序列，然后利用T7启动子线性扩增成RNA序列，扩增过程中引入带有生物素标记 的UTP，最终形成RNA捕获探针。相比于该方法，本发明的优势之处在于通过实验捕获了单链 DNA捕获探针，使得探针的保存条件更加稳定，同时由于引入了带有甲基化修饰的DNA碱基， 增强了DNA分子的结合性。
[0015] 作为优选，步骤(2)中所述PCR引物为引物对，包括正向引物和反向引物，正向引物 的序列为5 ' -GAGCTTCGGTTCACGCAATG-3 '，反向引物的序列为5 ' -UGCCUAGGACCGGAUCAAC-3 '。 [0016]作为优选，步骤(2)的PCR反应体系中，含有dUTP的PCR引物的终浓度为0.5μΜ。
[0017] 本发明的有益效果是:对于环境和操作的要求较低，保留了 RNA:DNA核酸分子极强 结合能力的性能，本发明极大了降低了生产成本、使用范围广，包括任意物种基因组的外显 子区域、内含子区域、线粒体区域以及内含子区域等。所获得的DNA杂交探针可以应用于二 代测序靶向文库的构建以及测序。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0019] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0020] 总实施方案：
[0021 ] -种用于靶向杂交捕获的修饰性DNA杂交探针的制备方法，包括以下步骤：
[0022] (1)通过平行制备寡核苷酸池获得包含目标序列以及通用引物区域的DNA模板。
[0023] (2)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物进行PCR反应，同时在PCR过程中引入 生物素标记的ATP和甲基化dm5CTP;所述PCR引物为引物对，包括正向引物和反向引物，正向 引物的序列为5 ' -GAGCTTCGGTTCACGCAATG-3 '（ SEQ ID No · 1)，反向引物的序列为5'_ UGCCUAGGACCGGAUCAAC-3 '（SEQ ID No. 2)，正向引物和反向引物由上海生工合成。PCR反应 体系中，含有dUTP的PCR引物的终浓度为0.5μΜ。
[0024] (3)磁珠富集法纯化PCR产物。
[0025] (4)对纯化后的PCR产物进行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化。
[0026] (5)磁珠富集法纯化步骤(4)处理后的产物。
[0027] (6)Lambda核酸外切酶水解步骤(5)纯化后产物的双链DNA中一条带有5'端磷酸化 的单链，从而获得带有生物素标记的单链DNA。
[0028] (7)磁珠富集法纯化带有生物素标记的单链DNA，得修饰性DNA杂交探针。
[0029]具体实施案例：
[0030] 1、试剂和仪器
[0031] 1.1试剂
[0032]
[0035] 2、操作流程
[0036] A.使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物进行PCR反应，PCR反应体系如下：
Γ ? 终浓度 体积
[0037]
[0038]
[0039] 在PCR仪中执行以下反应程序：
[0040]
L0041J
[0042] B.Beads 纯化 PCR 产物
[0043] 1.向每管PCR产物中加入3.5倍体积已充分混匀的beads(室温)并彻底混匀(移液 枪吹打15次）；
[0044] 2.室温孵育 5min;
[0045] 3.将反应管置于磁力架上至少3min或直至液体澄清；
[0046] 4.将反应管留在磁力架上用移液枪吸取并弃掉上清；
[0047] 5.保持反应管于磁力架上加入200μ1 (新鲜配置)70 %的乙醇溶液，静置30s，然后 用移液枪弃去乙醇;重复乙醇清洗步骤1次；
[0048] 6.两次乙醇清洗后，尽可能多的去除乙醇;将反应管置于室温干燥5min;注意不要 将beads过度干燥(通常7~lOmin);
[0049] 7.干燥完成后，从磁力架上取下反应管并加入18μ1 Nulease-free water，充分混 匀；
[0050] 8.将反应管放回磁力