NA质量并不好。目 前微生物多样性研究的扩增循环数有选择25的，也有选择30的，还有一些其他的选择，但结 果不好判定。总之在样品准备的过程中，尚没有标准操作方法。 实施例
[0026]为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的 实施例如下。其中所用微生物均由华中农业大学生命科学技术学院农业微生物学国家重点 实验室提供，所用无机盐均购自常规化学试剂供应商，所述操作均为常规操作。
[0027]复杂样品以土壤为例，简单样品以食糜为例。土壤样品为山东冬季未经围填的距 离围填海区域1.5公里、距表层15 cm的植物根系土壤;食糜样品为羊瘤胃胃液。
[0028] (1) DNA提取 a. 直接称取250mg土壤样品进行后续操作;对于食糜样品，首先吸取1.5ml置于离心管 中，12000g离心5min，除去上清，然后加入1.5ml PBS，充分重悬后，12000g离心5min，再次除 去上清后保留沉淀进行后续操作； b. 加入800 1 CTAB缓冲液，在涡旋振荡器上击打2min(CTAB的配方：CTAB 4g，NaCl 16.364g，lM Tris-HCl 20ml (ρΗ8·0), 0.5M EDTA 8ml，先用70ml dd H20溶解，再定容至 200ml灭菌）； c. 加入0.3g 0.1mm研磨珠和O.lg 0.5mm研磨珠，在祸旋振荡器上击打30min; d. 70°C 解育20min后，10000g离心10min; e. 将上清转移到新的离心管中，加入5μ1 RNAase (10mg/ml)，37°C孵育30min; f. 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)，涡旋震荡30s至液体呈白色乳浊液； g. 12000g 4°C离心10min，取上清液至新的离心管中； h. 重复步骤e、f和g-次； i .加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置5min，然后于-80°C放置30min沉淀 DNA； j · 12000g离心15min，可以看到白色DNA沉淀； k. 小心倒出上清，加入750μ1 70%的乙醇，充分重悬白色沉淀； l. 12000g离心15min，倒出上清，倒置离心管室温放置10min; m. 加入50μ1 70°C预热的去离子水，充分溶解。
[0029] (2) PCR扩增 a.扩增片段选择16s V3区，扩增引物： 338F:5'-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' 518R:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'
(3)文库构建 扩增后的产物经凝胶回收后，按照每个样品1 〇〇ng混勾，使用Bi〇〇 Sc ientif i c公司的 Nextflex rapid DNA sequencing kit进行建库。
[0030] a.吸取32ul上述混匀的PCR产物至新的PCR管，不足32ul用水补足； b. 每管加入 15ul NEXTflex End-Repair & Adenylation Buffer Mix和3ul NEXTflex End-Repair & Adenylation Enzyme Mix，混勾 10次； c. 22°C孵育20min;然后72°C孵育20min; d. 冰上每管再加入以下试剂： NEXTflex Ligase Enzyme Mix 47.5ul NEXTflex DNA Barcode 2.5ul 最终使体系成为l〇〇ul; e. 22°C孵育 15min; f. 向体系中加入160ul充分混匀的AMPure XP beads，轻轻吹打均匀，室温孵育15min; g ·室温放置磁力架至少5min，使磁珠充分吸附在磁力架上，吸弃上清； 注：以下用80%乙醇的洗杂步骤，反应管均置于磁力架上进行； h. 向置于磁力架上的反应管中加入200ul 80%乙醇，室温孵育30s，吸弃上清； i. 重复步骤h; j. 室温静置15min以晾干磁珠； k. 每管加入52.5ul RSB(Resuspension Buffer)，充分混勾磁珠； l. 室温孵育2min，然后磁力架静置5min，吸取50ul上清至一新的EP管； m. 每管再加入50ul充分混匀的AMPure XP beads，轻轻吹打均匀，室温孵育15min; η ·室温放置磁力架至少5min，使磁珠充分吸附在磁力架上，吸弃上清； 以下用80%乙醇的洗杂步骤，反应管均置于磁力架上进行； 〇.然后向置于磁力架上的反应管中加入200ul 80%乙醇，室温孵育30s，吸弃上清； P.重复步骤〇; q. 室温静置15min以瞭干磁珠，每管加入22.5ul RSB(Resuspension Buffer)，充分混 匀磁珠； r. 室温孵育2min，然后磁力架静置5min，吸取20ul上清至一新的PCR管。
[0031] s ·每管加入 2ul NEXTflex Primer Mix，再加入 12ul NEXTflex PCR Master Mi x，补水16u 1，将体系调整到50u 1，充分混匀； t. 按以下程序进行PCR
u. 凝胶回收扩增产物，要求:2%凝胶，预冷TAE buffer，120vi*1.5-2h。
[0032] (4)上机测序和数据分析 文库经2100检测和QPCR定量后，在Miseq机器上采取PE 2*150的模式进行测序。下机的 测序数据需要经过数据分析才能得到样品中微生物的群落组成。对测序得到的原始数据进 行过滤，去掉接头和低质量的reads，得到可用于后续分析的clean data，并用fastqc软件 对数据进行质量评估。然后使用FLASH软件对clean data进行组装，获得更多含barcode的 reads。然后使用QHME软件根据barcode序列将该组装结果回归样品，并对每个样品的序列 数进行统计。然后使用uclust软件根据序列相似性（阈值为97%)进行聚类，得到0TU(操作分 类单元)序列，并进行优化和分类。本研究采用菌群丰富度指数chaol、ACE，菌群多样性指数 Simpson、Shannon和菌群覆盖度指数goods coverage、observed species对菌群进行多样 性分析。最后使用green genes数据库(201305版本)并根据分类学分析结果，分析样品在各 分类水平上的物种组成比例情况。
[0033] S-TG:天根提取的土壤样品DNA; S-N:新方法提取的土壤样品DNA; C-TG:天根提取的食糜样品DNA; C-N:新方法提取的食糜样品DNA。
[0034] 表2不同提取方法对微生物种类的影响
表3不同扩增循环数对微生物种类的影响
仕刖IMJtfJ畑迚十，符河伞观项忟不八臾牡芴芴见的定P」河込生仅明;ii行 不同的替换和修改而不偏离本发明的范围和精神。这里说明性描述的本发明可在无任何未 在此具体公开的元素或元素、限制或限制的情况下实践。已被使用的术语或表述被用作说 明书的术语而不是限制，且不旨在使用排除任何所显示和描述的其部分的特征的等同物的 这样的术语和表述，但认识到的是在本发明的范围内多种修饰是可能的。因此，应理解的 是，尽管已通过具体实施方案和任选的特征说明了本发明，领域技术人员可进行这里公开 的概念的修饰和/或变化，且这样的修饰和变化被认为是在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包括： (1) 将含微生物的样品加入CTAB缓冲液并振荡； (2) 加入至少两种不同粒径的研磨珠并振荡； (3) 37-90°C解育5-60min后离屯、取上清； (4) 在步骤(3)得到的上清加入RNAase并解育； (5) 加入苯酪/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离屯、取上清； (6) 在步骤巧)得到的上清中加入乙醇或异丙醇沉淀DNA; (7) W步骤(6)得到的DNA为模板，进行PCR扩增，得到用于检测的样品。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述不同粒径的研磨珠为至少两种不同粒径的研 磨珠，其粒径各自独立地在0.05 mm至1 mm的范围内且相邻大小的粒径相差0.1至0.6 mm。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(3)中，60-80°C解育10-30min后离屯、取 上清;更优选地，70°C解育20min后离屯、取上清。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述苯酪/氯仿/异戊醇的混合物的体积为步骤 (4)中的上清体积的1-1.5倍;优选地，所述苯酪/氯仿/异戊醇的混合物的体积与步骤(4)中 的上清体积相等； 优选地，所述苯酪/氯仿/异戊醇的混合物中苯酪/氯仿/异戊醇的体积比为10-50:10-50:0.5-2;更优选地，苯酪/氯仿/异戊醇的体积比为20-30:20-30:1;最优选地，苯酪/氯仿/ 异戊醇的体积比为25:24:1。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PCR扩增进行25个循环。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PCR扩增进行30个循环。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PCR扩增的目的片段为所述微生物的16s V3区;优选地，其中所述PCR扩增的扩增引物为： F:5'-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' R:5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'。8. -种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包括： (1) 将含微生物的固体样品加入CTAB缓冲液中并振荡； (2) 加入0.1 mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振荡； (3) 70°C解育20min后离屯、取上清； (4) 将上清加入RNAase并解育； (5) 加入等体积的25:24:1的苯酪/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离屯、取上清； (6) 重复步骤(4)和巧）； (7) 加入乙醇或异丙醇沉淀DNA; (8) 离屯、得到白色DNA沉淀，用乙醇洗涂后溶解在去离子水中； (9) W步骤(8)得到的DNA为模板，进行PCR扩增25或30个循环，得到用于检测的样品。9. 一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法，包括： (1) 将含微生物的液体样品离屯、除去上清，加入PBS充分重悬后，再次离屯、除去上清后 向沉淀中加入CTAB缓冲液中并振荡； (2) 加入0.1 mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振荡； (3) 70°C解育20min后离屯、取上清； (4) 将上清加入RNAase并解育； (5) 加入等体积的25:24:1的苯酪/氯仿/异戊醇的混合物，振荡后离屯、取上清； (6) 重复步骤(4)和巧）； (7) 加入乙醇或异丙醇沉淀DNA; (8) 离屯、得到白色DNA沉淀，用乙醇洗涂后溶解在去离子水中； (9) W步骤(8)得到的DNA为模板，进行PCR扩增25或30个循环，得到用于检测的样品。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述PCR扩增的目的片段为所述微生物的16s V3区；所述PCR扩增的扩增引物为：
【专利摘要】本发明涉及微生物多样性检测领域，具体涉及一种适用于高通量测序平台的微生物多样性检测样品制备方法。主要解决目前多样性测序过程中尚无统一的样品制备方法标准，导致结果良莠不齐的问题。本发明针对复杂和一般性样品，在DNA提取方法和扩增循环数的选择上都做了比较和改进，通过最终测序数据的比较，确定了一套针对不同样品的标准制备方法。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105647906
【申请号】
【发明人】安云鹤, 田彦杰, 王金龙, 武会娟, 李越, 高丽娟, 马凯
【申请人】北京市理化分析测试中心
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月21日