一种外切-α-1,4-糖苷酶与其编码基因和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种外切-α-l，4-糖苷酶及其编码基因与应 用。
【背景技术】
[0002] α-葡萄糖苷酶是一类能从多糖的非还原端，以水解α-l，4-糖苷键的方式，释放α-葡萄糖残基的酶。这类酶广泛存在于动植物和微生物体内。
[0003] 根据底物特异性的不同，α-葡萄糖苷酶分为三类:I.偏好水解蔗糖和对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷之类底物;II.偏好水解麦芽糖和麦芽寡糖;III.对淀粉类底物有较高活 性，同时也能水解麦芽糖和麦芽寡糖。
[0004] 大多数糖基水解酶31家族的α-葡萄糖苷酶(31AGs)表现出II型或III型底物特异 性，但是糖基水解酶13家族的α-葡萄糖苷酶（13AGs)表现出I型底物特异性。13AGs含有三个 保守结构域：（β/α) 8折叠桶结构(结构域A)、结构域A中3个α螺旋和3个β折叠构成的环状结 构(结构域Β)、回形钥匙拓扑结构(结构域C)。
[0005] 迄今为止，已经有很多研究发现微生物产生的胞内α-葡萄糖苷酶对维持生物体的 正常生理功能起着重要作用。α-葡萄糖苷酶可催化麦芽糖和糖原降解为葡萄糖，它是在人 类和哺乳动物组织中糖原降解方面的重要的酶，如果人类和哺乳动物缺失葡萄糖苷酶， 会导致糖原代谢紊乱。
[0006] 与此同时，α-葡萄糖苷酶作为工业化生产低聚异麦芽糖的关键酶制剂，倍受国内 外食品工业界的重视。低聚异麦芽糖由2-10个葡萄糖残基构成，分子中至少有一个α-l，6_ 糖苷键，其他为α-l，4-糖苷键。由于此类低聚糖具有显著的防止龋齿和促进双歧杆菌增殖 等功效，正日益受到消费者的青睐。低聚异麦芽糖的生产以淀粉为原料，经淀粉酶水解为 麦芽糊精后，再由葡萄糖淀粉酶和葡萄糖苷酶共同作用而成低聚麦芽糖。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种新的外切-α-l，4_糖苷酶与其编码基因及 其应用。
[0008] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0009] -种外切-α-l，4-糖苷酶，该蛋白质：
[0010]具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的蛋白质；或该蛋白质具有在SEQ ID NO. 1所 示的氨基酸序列基础上缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的衍生序列并且该蛋白 质具有外切淀粉酶活性。
[0011] 所述外切淀粉酶活性指能以外切α-l，4_糖苷键的方式，作用于可溶性淀粉、支链 淀粉等淀粉类底物。
[0012] 为了使上述蛋白质便于纯化，可在上述的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或 羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0013] 表1标签的序列
[0014]
[0015] 上述蛋白质可以人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述中 的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列中，缺失、置换、插入或添加 一个至几个，或者连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 本发明所提供的外切-α-l，4-糖苷酶属于糖基水解酶13家族。
[0017] SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列由553个氨基酸残基组成。
[0018] -种外切-α-1，4_糖苷酶的编码基因，该基因编码：
[0019] (a)具有SEQ ID NO. 1所不的氣基酸序列的蛋白质；或
[0020] (b)具有衍生自缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸序列并具有外切淀粉酶活性的蛋白质。
[0021 ] 进一步，所述外切-α-l，4-糖苷酶的编码基因为(i)、（ ii)或（iii)的DNA分子：
[0022] (i)具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA分子；
[0023] (ii)在严格条件下与（i)所述的核苷酸序列杂交且编码具有外切淀粉酶活性的所 述蛋白的DNA分子；
[0024] (ii i)与（i)或（ii)所述的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列的DNA分 子。
[0025] SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列由1662个核苷酸组成。
[0026] 进一步，所述严格条件为钠浓度为50-300mM的溶液中，反应温度为50-68°C。
[0027]例如:在进行分子杂交的过程中，可以为在6 X SSC、质量分数为0.5%的SDS的溶液 中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC，质量分数为0.1 %的SDS和1 X SSC、质量分数为0.1 %的 SDS各洗膜一次。其中SDS的中文名称为十二烷基硫酸钠，1 X SSC包括0.15mol/L NaCl和 0.015mo 1 /L柠檬酸;SDS以及不同浓度倍数的SSC均为本领域的常用试剂。
[0028] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。
[0029] 本发明提供一种重组载体，包括上述的外切-α-l，4_糖苷酶的编码基因。
[0030] 所述重组载体为将上述任一所述编码基因插入出发载体(例如:pET28a)的多克隆 位点得到的重组表达载体。
[0031] 可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组 表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们 可单独使用或与其它的启动子结合使用;此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还 可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻 接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述 翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区 域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0032] 本发明还提供一种转化体，包括上述的重组载体。
[0033]转化体可以为重组菌，例如，将上述任一所述编码基因插入出发载体（例如： pET28a载体)的多克隆位点得到的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
[0034] 本发明还提供一种生产外切-α-1，4_糖苷酶的方法，该方法包括培养上述述的转 化体并由培养产物中收集外切-α-l，4_糖苷酶。收集的外切-α-l ,4-糖苷酶可以进一步进行 纯化。
[0035] 本发明还提供一种引物对，用于扩增上述的外切-α-l，4_糖苷酶的编码基因全长 及其任意片段。
[0036] 例如：引物对的序列如SEQ ID Ν0.3和SEQ ID Ν0.4所示。
[0037] 上述任一所述蛋白质、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组表达载体、所述 表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在降解可溶性淀粉、支链淀粉或P-硝基苯-α-D_吡喃葡萄糖苷中的应用也属于本发明的保护范围。
[0038] 一种上述的外切-α-l，4_糖苷酶在水解α-l，4糖苷键中的应用。例如：用于水解ρ-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、可溶性淀粉或支链淀粉等。
[0039] 在具体应用的过程中，可以采用下面的方法：以可溶性淀粉、支链淀粉或p-硝基 苯-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物，在中性pH条件，利用外切-α-l，4-糖苷酶对可溶性淀粉、支链 淀粉或P-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷进行酶解。
[0040] 所述的降解条件包括:反应体系的温度30-45Γ，优选为40°C，反应体系的pH值为 6-8.8,优选为7.0。
[0041] 本发明还提供一种生产外切-α-l，4_糖苷酶的方法，该方法包括培养上述的转化 体并由培养产物中收集外切-α-l，4_糖苷酶。
[0042]本发明的有益效果是：
[0043]本发明所述的蛋白质具有外切淀粉酶活性，属于外切淀粉酶。并且该蛋白与其他 已表征的α-l，4_糖苷酶的氨基酸序列相比，相似性不大于65%，属于a-葡萄糖苷酶家族中 一员。
[0044]本发明所述的蛋白质可以广泛应用于α-l，4_糖苷键的酶解。
[0045]本发明所述外切-α-l，4_糖苷酶最适天然底物为支链淀粉，且具有在中性pH条件 下活性高的特性。
[0046]本发明对p-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)也有很好的酶活，实验表明：本发明 所述外切-α-l，4-糖苷酶，以pNPG为底物，在40°C、pH为7.0的条件下具有最高的酶活性，为 288·89mU/mg蛋白；该酶在30-45°C温度范围内，酶活均较高；在pH 6·0至pH 8·8的pH值范围 内，酶活均较高。该酶在PH6.2-8.6的条件下保持16h，依然有60%以上的酶活性，具有很好 的pH耐受性。
【附图说明】
[0047] 图1为Amy 112蛋白纯化前后的SDS-PAGE电泳图。
[0048] 图2为外切-α-l，4-糖苷酶的活性随温度的变化的结果。
[0049] 图3为外切-α-l，4-糖苷酶的活性随pH的变化的结果。
【具体实施方式】
[0050] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0051 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]实施例1、蛋白及基因的制备与功能
[0054]基因及蛋白的制备
[0055] 1、模板DNA的制备可以分别通过以下两种方式进行：
[0056] (1)嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. 703总DNA的提取：采用芽孢杆菌Bacillus sp. 703，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mM Tri s缓冲液中（pH8.0)，加入少量溶菌酶和 8毫升0.25mM EDTA(pH8.0)，混匀后37°C放置20min;之