拟南芥tt4基因在植物抗盐方面的新应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程应用技术领域，具体涉及拟南芥TT4基因(拟南芥基因组编码为At 5g 13930 )在培育耐盐植物新品种方面的应用。
【背景技术】
[0002]当前，全球水资源短缺日趋加剧，而人类大量使用化肥使土壤盐渍化日益严重，制约了农业的持续生产和发展。随着分子生物学和基因工程研究的深入，国际上很多科技工作者也在努力寻找与植物抗盐相关的基因，拟通过基因工程技术改良作物的抗盐性，但是目前可利用的成果甚少。
[0003]拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科鼠耳芥属植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，是植物遗传学、分子生物学常用的模式植物之一，也常用于植物逆境条件下抗性基因研究。
[0004]现有研究一般认为种皮的颜色除作为一个形态指示形状外，也常与植物品质有所关联，因此利用模式植物拟南芥开展种皮色素形成调控机理的研究也有较多成果。拟南芥种皮中色素主要是类黄酮，确切的说是花青素中的原花青素和栎精中的黄酮醇。TT4基因(拟南芥基因组编码为At5gl3930)是调控拟南芥种皮色素的基因之一，该基因所编码的CHS蛋白作为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶，催化类黄酮合成途径的第I步反应，即:4-_香豆酰-Co (I分子)+丙二酰-CoA( 3分子)—缩合形成查尔酮(又称苯基苯乙烯酮，Chalcone)。而查尔酮为其他类黄酮合成提供基本骨架，因此CHS蛋白催化的反应是整个类黄酮合成途径的重要限速步骤。已有的研究发现，TT4基因突变后类黄酮合成缺失引起拟南芥种皮色泽的变异，而这些聚酮化合物在植物器官着色、病虫害防护和紫外辐射抵御等方面扮演着重要角色，然而关于此基因的其他用途，特别是植物抗盐方面的研究尚无报道。
【发明内容】
[0005]在对TT4基因(At5gl3930基因)深入研究基础上，发明人提供了 TT4基因(At5gl3930基因)在植物抗盐特性方面的新应用，从而为培育抗盐植物新品种提供新的可能性。
[0006]本发明所采用的技术方案如下所述。
[0007]拟南芥TT4基因在植物抗盐方面的新应用，所述TT4基因为拟南芥基因组编码At5gl3930基因，其⑶S长度为1188 bp，编码395个氨基酸的蛋白，该基因与种子活力相关，该基因突变后使拟南芥种子活力得到释放，即:该基因突变后可增强种子活力，使种子萌发更为迅速，萌发能力更强;进一步模拟干旱及模拟盐渍环境实验表明，该基因突变后可提高种子在萌发初期耐受盐胁迫(NaCl胁迫)和干旱(甘露醇模拟干旱)生长环境的能力，换言之，该基因突变后，可使种子萌发时耐受盐胁迫或干旱胁迫生长环境的能力得到增强。
[0008]进一步实验表明，TT4基因突变后，可使拟南芥种子在萌发初期耐受不超过400 mM甘露醇的模拟干旱的胁迫生长环境，或可耐受不超过150 mM NaCl的盐胁迫生长环境;在拟南芥种子萌发后，可耐受生长环境中不超过300 mM甘露醇的模拟干旱的胁迫生长环境，或可耐受不超过150 mM NaCl的盐胁迫生长环境。
[0009]现有研究一般认为，拟南芥TT4基因主要是作为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶，参与调控了拟南芥的种皮和种皮色素的发育。而本发明通过对拟南芥TT4基因(At5gl3930基因)在模拟干旱或高盐逆境中的研究，发现该基因特异性的调控植物对盐等引起的渗透胁迫反应，进一步将该基因沉默掉后，其突变体植株在萌发初期表现出较好地抗盐特性。因此通过该基因的进一步研究和转化，可以将其用于培育新的优良的耐盐植物新品种。
【附图说明】
[0010]图1为拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体通过TTC染色法测定种子活力的结果；图A为拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体着色情况，其中Control组为对照组，为自然结实后种子情况，从图中可以看出，野生型(WT)种子具有较深的天然色泽，而突变体种子则表现为近似无色；图B为拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体着色种子所占比例的统计结果，其中横坐标的“Stained Seeds”表示着色(染色)种子；
图2为拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体在添加不同浓度NaCl的MS培养基上培养两周时种子的萌发情况统计结果；
图3为拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体在添加200 mM NaCl的MS培养基上培养时的萌发情况，其中图A为拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体在添加200 mMNaCl的MS培养基上培养一周时种子萌发情况；图B为拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体在添加200 mM NaCl的MS培养基上5天内种子每天的萌发情况统计结果；
图4为TT4基因的组织表达定位情况，其中图A为拟南芥生长7天时转基因幼苗中TT4基因的组织表达情况；图B为子叶、茎中TT4基因的组织表达情况；图C为根毛区中TT4基因的组织表达情况；图D为根成熟区中TT4基因的组织表达情况；图E为根尖和分生区中TT4基因的组织表达情况;图F为TT4基因在花器官中的组织表达情况;图G为TT4基因在花中表达情况；图5为野生型与tt4-2突变体在300mM甘露醇、150 mM NaCl处理下的生长情况;其中A为将野生型与tt4-2突变体的种子直接点到胁迫培养基中生长15天后的表型;B为正常培养基中生长的幼苗移栽到胁迫培养基后，野生型与tt4-2突变体幼苗的生长情况。
【具体实施方式】
[0011 ]下面结合实施例对本发明做进一步地解释说明。
[0012]实施例1
本实施例主要对TT4基因(At5gl3930基因)与植物种子活力的关系进行简要说明。
[0013]前期基础研究过程中，发明人认为TT4基因(At5gl3930基因)与植物种子活力相关，为此，发明人以拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体为例对此结论进行了对比实验验证。相关实验过程介绍如下。
[0014]将干燥后的拟南芥野生型(WT)、tt4_2和tt4_3突变体种子分别置于含有氯化三苯四唑氮(TTC)的溶液中，温度30°C，避光染色48h，观察并统计种子的着色请况。
[0015]所述tt4-2和tt4-3突变体均为从拟南芥资源中心获得的TT4基因(At5gl3930基因)分别通过基因敲除三个碱基、多一个碱基的突变体(具体突变情况为:tt4-2突变体在5号染色体4489272?4489274的位置敲除掉三个碱基TGC; tt4_3突变体在5号染色体4489274的位置插入一个碱基C，致使其发生移码突变)，该突变体的TT4基因失活，不能正确编码相关蛋白质。
[0016]需要说明的是，采用氯化三苯四唑氮(TTC)染色种子(种子生活力四唑染色测定法)是一种判定植物种子活力较为直观的方法，由德国的H.Lakon于1942年首先发明，1995年我国将其列入农作物种子检验规程，其原理是无色的三苯基四氮唑被种子吸收后，在胚部活细胞中脱氢酶的作用下还原成红色、稳定、不扩散的三苯基甲，因而可根据染色的部位和深浅来直观的反应和区分种子的活性。
[0017]实验结果如图1所示。从图中可以看出，tt4_2和tt4_3突变种子被染成红色的比例明显比野生型(WT)植株种子多，且着色较深。这表明TT4基因(At5gl3930基因)突变后拟南芥种子的活力得到了增强。
[0018]实施例2
在实施例1基础上，发明人认为TT4基因突变后可以提尚种子的活力，也有可能提尚其耐盐能力，因而发明人做了进一步的实验验证。相关过程简要介绍如下。
[0019]将拟南芥野生型(WT)、tt4-2和tt4-3突变体种子分别播种于含有100 mM NaCK150 mM NaCU200 mM NaCl的MS培养基上，同时设置未添加其他物质的MS培养基作为对照，MS培养基琼脂质量含量为0.6%。
[0020]所述tt4_2和tt4_3突变体来源同实施例1。
[0021]种子播种完成后，培养生长环境为:光/暗周期为8/16h，温度22°C，黑暗温度18°C，相对湿度70%，光照强度90 nmol.m-2.s—1。
[0022]对拟南芥种子萌发过程进行具体观察并统计种子的萌发率。
[0023]实验结果如图2、3所示。从图中可以看出，盐胁迫条件下，随着盐浓度的升高，野生型(WT)植株种子萌发率逐渐下降，且浓度越高，种子萌发率下降越明显；而TT4基因突变体(tt4-2和tt4-3突变体)种子的萌发率在一定盐浓度(150 mM NaCl)的条件下，其萌发率不受影响，只有在盐浓度超过一定程度时才造成种子萌发率的下降，但在200 mM NaCl浓度条件下，即使野生型(WT)植株种子萌发率降低为O时，TT4基因突变体(tt4-2和tt4-3突变体)种子仍有较高萌发率;而就具体突变类型而言，较高浓度盐环境条件下，tt4-2突变体又比tt4-3突变体种子萌发率稍高。而且在实际观察中，TT4基因突变体(tt4-2和tt4-3突变体)种子萌发速度也较野生型(WT)种子萌发速度快。
[0024]需要解释的是，对TT4基因耐盐功能验证同时，发明人设计有相关的渗透对照实验(以不同浓度甘露醇研究渗透压影响，由于该部分实验与本申请关联度不高，因而不再单独说明)，最终结果表明，TT4基因耐盐功能实现不依赖于渗透因素，而仅与盐的作用相关。
[0025]实施例3
基于实施例2的研究结果，发明人认为有必要对TT4基因在拟南芥组织中的表达情况进行进一步分析，相关实验过程简要介绍如下。
[0026]对TT4基因在拟南芥组织中的表达情况进行分析时，所采取的技术方案为:将TT4基因启动子与PCAMBIA1391载体上的⑶S报告基因的编码区融合，构建pTT4-pCAMBIA1391载体，