r>[0045] PCR反应如下表：
[0046] 表 1
[0047]
[0048] PCR反应3后回收长度约4000bp的片段，swal和ppuMI酶切处理PCR产物及 PCDNA3. 1-LBNSE并进行连接、转化，挑取阳性克隆，测序鉴定，测序引物为Tsp: GAGCAATATAACAAAAAACATG 〇
[0049] 1.3重组病毒LBNSE-DCBp的拯救
[0050] 参见文献（Wen Y,Wang H，Wu H, Yang F,Tripp RA，et al · (2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination. J Virol 85:1634-1 ·) 〇具体如下：车专染前一 天将BSR细胞接种于六孔板，使细胞于第二天使用时达到80%的覆盖度，按照转染试剂 Superfect(QIAGEN公司）的产品说明说进行操作，将2ug的全长感染性克隆，0.5ug N辅助质 粒，0.25ug P辅助质粒，0.15ug G辅助质粒以及O.lug L辅助质粒共同转染BSR细胞，转染后 的细胞放入37°C培养箱，⑶2浓度为5%，孵育4小时，然后将上清倒掉，用含10%FBS的DMEM 培养基洗一次，再加入新鲜培养基培养。转染后4天，7天移去旧的培养基，更换新鲜培养基， 并从第7天开始检测病毒拯救结果。
[0051 ] 1.4拯救病毒的鉴定
[0052]将拯救的病毒与BSR细胞于96孔细胞板共培养48小时后，将上清弃掉，用预冷的 80 %丙酮于4 °C固定30分钟，然后用PBS洗2遍，将异硫氰酸荧光素 （Fluoresce in isothiocyanate，FITC)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体(购于Fujirebio公司）进行1: 125稀释，每孔加入50ul，放入37°C孵育1小时后用PBS洗三遍，在荧光显微镜（Leica DMIRES)进行观察。
[0053] 1.5病毒滴定
[0054]取96孔细胞培养板，以4行X 9列为一个样品区，每板两个分区，将每个孔内加入90 μL的含10 %FBS的DMEM细胞培养液，每个样品设4个重复，将10μ1的病毒原液加入到96孔细 胞板的第一列，充分混合后吸取1〇μ1混合液到第二列，充分混匀，再吸出l〇ul混合液到下一 列，依次连续进行10倍的倍比稀释，至第9列孔后弃掉10μ1的混合液。每孔加入5X10 4的BSR 细胞后于37°C，5 %C02培养48h，然后弃细胞上清液，用80 %冷丙酮固定感染细胞。以抗狂犬 病毒N蛋白焚光抗体(FITC-conjugated anti-RV N antibodies)染色后，通过焚光显微镜 观察并记录抗原阳性区域(Antigen-positive foci)。根据Reed-muench法进行病毒毒力的 计算并记录为FFU/ml(Fluorescent focus units per milliliter) 〇
[0055] 1.6重组病毒LBNSE-DCBp在BSR细胞上的生长特性
[0056] 将病毒以感染复数为0.01 (Μ0Ι = 0.01)感染BSR细胞，分别在感染后第1天，第2天， 第3天，第4天及第5天取50μ1的上清液，进行病毒滴定，记录病毒在不同时间点的滴度，并绘 制出生长曲线。
[0057] 1.7体外验证DCs的激活
[0058] 从6-8周龄此行Balbc小鼠的大腿骨中取BMC(骨髓细胞）以2 X105的密度重悬于含 有20ng/ml鼠 GM-CSF的10 %的1640培养基中，并于5 %⑶2的37°C温箱中培养。培养的1，3，5 天半换液，于第7天收集全部细胞，按1 X 106铺于12孔板中。24h后按照Μ0Ι = 1的比率感染 LBNSE，LBNSE-DCBp和LBNSE-DCCp，LPS作为阳性对照。感染后24小时，收集细胞，流式检测 ⑶1 lc，⑶86和⑶80，比较各组DCs激活的比例及平均荧光强度。
[0059] 1.8动物实验
[0060] 1.8.1重组病毒LBNSE-DCBp致病性实验
[0061 ] 将6-8周龄的ICR小鼠，每组10只，分别用40μ1的DMEM或者1 X 107FFU的重组病毒 LBNSE，以脑内注射（i . c.)的方式进行感染，观察每天观察两次，记录小鼠的临床发病及死 亡情况。
[0062] 1.8.2小鼠免疫试验
[0063] 将6-8周龄的Balbc小鼠，每组6只，分别用无菌注射器将100ul含有1X106FFU的 LBNSE毒株和1 X 106FFU的重组病毒株LBNSE-DCBp进行大腿肌肉注射免疫或口服免疫，并分 另IJ于免疫后第2周、第3周、第4周、第5周、第6周进行采血测定中和抗体水平。
[0064] 1.8.3小鼠保护率实验
[0065] 将6-8周龄的ICR小鼠，每组11只，免疫后21天，经脑感染狂犬病毒强毒株CVS24,感 染后每天记录观察小鼠的发病及死亡情况，统计各组疫苗对小鼠的保护率。
[0066] 2.实验结果
[0067] 2.1感染性克隆LBNSE-DCBp的构建及拯救病毒检测
[0068] LBNSE毒株是在SAD-B19的基础上在G基因194位和333位进行突变，并且将G和L基 因之间的假基因敲除，加入两个酶切位点BsiWI和Nhel。重组病毒LBNSE-DCBp或LBNSE-DCCp 是在LBNSE病毒的基础上，将DCBP或者DCCP(对照）小肽按照图1所示的策略PCR扩增后连入 到G基因信号肽序列之后（图2)，利用反向遗传技术拯救病毒，拯救的病毒用免疫荧光实验 进行检测，可以看到绿色的焚光灶。另外，为了检测DCBp基因是否已插入到拯救的病毒中， 将拯救的病毒感染BSR细胞后，提取RNA进行反转录PCR检测，检测引物TSP设计在信号肽序 列前，使用引物Tsp进行测序验证。
[0069] 2.2病毒的体外生长特性
[0070]为了研究DCBp基因的插入是否影响狂犬病毒自身的复制及增殖，将LBNSE毒株和 LBNSE-DCBp毒株感染BSR，并且于不同时间点测定其病毒的滴度，绘制出病毒的生长曲线 (图3)，可以观察到重组病毒LBNSE-DCBp和病毒LBNSE具有相似的生长曲线，这表明外源基 因 DCBp基因的插入并未影响病毒的复制和增殖，并且最高滴度与母本病毒也相差不大。重 组病毒LBNSE-DCBp在BSR细胞上达到的最高滴度为1 X 107.5FFU/ml在感染后第4天达到滴度 最高值。感染体外培养的树突状细胞，LBNSE-DCBp可以激活更多的树突状细胞(图5)。
[0071] 2.3重组病毒致病性及肌肉免疫后中和抗体产生
[0072] 重组病毒LBNSE-DCBp脑内注射6-8周龄的ICR小鼠中，观察2周，并记录体重（图4)。 期间并未出现任何发病症状，且体重影响不大，说明重组病毒对小鼠无致病性。
[0073] 2.4重组病毒免疫效果评价
[0074] 将重组病毒LBNSE-DCBp、LBNSE-DCCp或者LBNSE毒株分别肌肉免疫Balb/c小鼠，于 免疫后2周，3周，4周，5周和6周采血测定中和抗体滴度。诱导高的中和抗体水平是预防狂犬 病的有效手段，因此，中和抗体的测定作为狂犬病疫苗效果评价的方法。如图6所示，重组病 毒LBNSE-DCBp诱导的中和抗体水平要显著高于LBNSE毒株，在免疫后第4周中和抗体水平最 尚。
[0075] 将重组病毒LBNSE-DCBp、LBNSE-DCCp和LBNSE按1 X 106FFU的剂量肌肉或口服免疫 6-8周龄ICR小鼠，免疫后21天，经脑感染狂犬病毒强毒株CVS24,感染后每天记录小鼠死亡 情况（图7、图9、图11)。结果显示LBNSE-DCBp组对小鼠的保护率显著高于LBNSE-DCCp和 LBNSE 组。
[0076]总之，本发明中的重组狂犬病病毒LBNSE-DCBp对小鼠无致病性，安全性高。在免疫 效果上，与欧洲普遍用于野生动物口服免疫的疫苗株即实验中的母本株LBNSE相比，LBNSE-DCBp经口服免疫可以诱导产生更高的中和抗体水平;在灭活情况下，LBNSE-DCBp比对照毒 株也可以产生更高水平的中和抗体，提供更好的保护力。因此，重组狂犬病病毒LBNSE-DCBp 可以作为潜在的新型狂犬病口服疫苗或者灭活疫苗的候选疫苗株。
【主权项】
1. 一株重组狂犬病疫苗毒株，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。2. -种制备权利要求1所述重组狂犬病疫苗毒株的方法，其特征在于：以狂犬病毒 LBNSE毒株为母本，将DCBP肽基因插入到所述LBNSE毒株的G基因信号肽序列之后，然后利用 反向遗传技术拯救病毒，所述DCBP肽基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
【专利摘要】本发明公开了一株重组狂犬病疫苗毒株，其基因核苷酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。该毒株是以狂犬病毒LBNSE毒株为母本，将DCBP肽基因插入到所述LBNSE毒株的G基因信号肽序列之后，然后利用反向遗传技术拯救病毒，所述DCBP肽基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。该毒株具有较高的安全性。可以诱导产生更高的中和抗体，提供更好的保护力，可作为新型狂犬病口服疫苗或者灭活疫苗的候选株。
【IPC分类】C12N15/85, C12R1/93, C12N7/01
【公开号】CN105647878
【申请号】
【发明人】赵凌, 张雅春, 傅振芳, 周明, 崔旻, 李莹莹
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月4日