一种基于sis的细胞复合培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于SIS的细胞复合培养方法，属于细胞生物技术领域。
【背景技术】
[0002]目前人造血管可采用的主要材料有:涤纶、聚四氟乙烯、聚丙烯、硅橡胶等，但现有人造血管材料的组织相容性较差，且容易引发感染、炎症，因此组织相容性更好的人造血管材料是人们研究和寻找的方向。
[0003]SIS(小肠粘膜下层)是一种具有诱导/引导组织再生功能的膜材料，其用于修复重建膀胱、尿道、食管、骨及软骨具有良好的组织相容性，目前已有采用SIS作为基质构建用于食管、骨及软骨的组织工程材料的方法;HUVECs(人脐静脉内皮细胞)是一种取自新生儿脐带的血管内皮细胞，是血管内皮细胞体外实验的常用材料，但其属于低增长的细胞，在体外培养时存活及增值率较低，进行SIS与HUVECs的相容性，及HUVECs在SIS上的增殖、特性研究，对进行人造血管的组织工程材料研究有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种基于SIS的细胞复合培养方法，能够使HUVECs在SIS上大量增殖并紧密排列，并为研究组织相容性更高的人造血管材料提供基础。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供一种基于SIS的细胞复合培养方法，包括以下步骤:
[0006]A、SIS的制备:采用abraham法制备小肠粘膜下层；
[0007]B、HUVECs的原代培养:取新生儿新鲜脐带，磷酸盐缓冲液冲洗后，用注射器灌洗脐静脉，再将脐带一端夹闭，从另一端用注射器向所述脐静脉内注入消化酶溶液，消化后用注射器吸取消化液并收集，向所述消化液中加入含血清的培养液终止消化，吹打若干次后接种于培养瓶中，置37 °C 5 % CO2细胞培养箱中培养；
[0008]C、HUVECs与SIS的复合培养:取步骤A中获得的SIS制成大小均等的SIS小块，紫外灯照射消毒后放入细胞培养板中，用细胞培养液浸泡1-3天后，加入5-20%的牛血清，放入37°C细胞培养箱中孵育12-16h;取步骤B中培养的HUVECs，加入消化酶溶液消化后，收集消化液并加入含血清的培养液终止消化，将消化液离心后收集HUVECs细胞，并用含10-20 %牛血清的细胞培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释后种至放有SIS的细胞培养板中，放入370C 5 % CO2细胞培养箱内培养，每1-4天换液一次。
[0009]所述采用abraham法制备小肠粘膜下层的方法为:取猪小肠，清洁后去除小肠的浆膜层和肌层，将处理后的小肠在含有I OOmmo I /L乙二胺四乙酸和I Ommo I /LNaOH的溶液中浸泡12-18h，用去离子水将浸泡后的小肠清洗干净，再用含有lmmol/L HCl和lmmol/L NaCl溶液中浸泡5?1h，用去离子水清洗后在含有lmmo 1/L NaCl的磷酸盐缓冲液中浸泡12_18h，用去离子水清洗后在磷酸盐缓冲液中浸泡l-4h，再用去离子水冲洗2h，将制得的SIS在含有0.1 %过氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡6-1 Oh，用含有0.05%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液清洗1-4h，冷冻干燥后用γ射线照射消毒。
[0010]所述消化酶溶液为0.25%的胰蛋白酶溶液。
[0011]步骤B中的所述培养瓶内预铺有鼠尾胶原。
[0012]步骤C中所述细胞培养板为6孔板，所述细胞悬液的接种密度为2?5Χ15/孔。
[0013]步骤C中所述SIS小块的大小为2.5cm X 2.5cm。
[0014]本发明所达到的有益效果在于:
[0015]1.SIS主要有〗、m型胶原蛋白构成，有良好的细胞相容性，能促进可促进HUVECs的粘附、生长和分化，因此HUVECs可生长为排列紧密的细胞层；
[0016]2.SIS具有无抗原性，用于移植不会导致免疫反应，HUVECs来源于胎儿脐带，材料较易获取，因此以SIS和HUVECs作为人造血管的组织工程材料，具有更好的组织相容性。
[0017]因此，本发明所提供的一种基于SIS的细胞复合培养方法，材料较易获取，能够使HUVECs在SIS上大量增殖并紧密排列，并为研究组织相容性更高的人造血管材料提供基础。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0019]实施例一:
[0020]—种基于SIS的细胞复合培养方法，包括以下步骤:
[OO21 ] A、SIS的制备:采用abraham法制备小肠粘膜下层；
[0022]B、HUVECs的原代培养:取新生儿新鲜脐带，磷酸盐缓冲液冲洗后，用注射器灌洗脐静脉，再将脐带一端夹闭，从另一端用注射器向所述脐静脉内注入消化酶溶液，消化后用注射器吸取消化液并收集，向所述消化液中加入含血清的培养液终止消化，吹打若干次后接种于培养瓶中，置37 °C 5 % CO2细胞培养箱中培养；
[0023]C、HUVECs与SIS的复合培养:取步骤A中获得的SIS制成大小均等的SIS小块，紫外灯照射消毒后放入细胞培养板中，用细胞培养液浸泡I天后，加入5%的牛血清，放入37°C细胞培养箱中孵育16h;取步骤B中培养的HUVECs，加入消化酶溶液消化后，收集消化液并加入含血清的培养液终止消化，将消化液离心后收集HUVECs细胞，并用含10 %牛血清的细胞培养液制成细胞悬液，将细胞悬液稀释后种至放有SIS的细胞培养板中，放入37°C5%C02细胞培养箱内培养，每I天换液一次。
[0024]所述采用abraham法制备小肠粘膜下层的方法为:取猪小肠，清洁后去除小肠的浆膜层和肌层，将处理后的小肠在含有I OOmmo I /L乙二胺四乙酸和I Ommo I /LNaOH的溶液中浸泡12h，用去离子水将浸泡后的小肠清洗干净，再用含有lmmo I /L HCl和lmmo I /L NaCl溶液中浸泡5h，用去离子水清洗后在含有lmmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液中浸泡12h，用去离子水清洗后在磷酸盐缓冲液中浸泡lh，再用去离子水冲洗2h，将制得的SIS在含有0.1%过氧乙酸的20 %乙