一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种3-羟基丙酸的制备方法，特别涉及一种生产3-羟基丙酸的重组大 肠杆菌及其制备方法和应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 由于煤炭石油等不可再生资源日益减少，潜力巨大的燃油生物炼制技术受到越来 越多的关注，其中，生物柴油产业更是在近几年内迅速发展。然而，每生产10吨生物柴油就 会产生1吨甘油。甘油的生产增长迅速，致使甘油价格一路走低。充分利用来源丰富、价格低 廉的甘油，可以带来巨大的经济效益和环境效益。
[0003] 3-羟基丙酸(3-HP，C3H603)与乳酸为同分异构体，是一种重要的平台化合物，它无 色、无味，可以与水、醇、醚等多种溶剂互溶。由于具有羟基和羧基两个活性基团，因而在化 学反应中是多种化工原料的合成前体，也是构成很多高分子的单体，例如3-HP能够脱水生 成丙烯酸，氧化即成丙二酸，还原生成1，3_丙二醇，而这些都是重要的化工和日用品原料。 由于3-HP显著的市场价值及工业应用前景，2004年美国能源部报告将3-HP列为当今世界上 12种最具有开发潜力的化工产品之一。
[0004] 目前，3-羟基丙酸的生产方法是化学合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯氰转 化法。但在碳末端引入功能团有很大的难度，且其产品不易分离提纯，生产成本较高，生产 过程存在不安全因素，而微生物发酵方法生产3-ΗΡ可以有效的避免这些不利因素。相比化 学合成法，生物合成具有操作简便、条件温和、绿色环保的优点，因而越来越多的科研工作 者将研究重点放在了生物合成途径上。
[0005] 微生物产3-ΗΡ早在上世纪60年代就有报道，但是天然存在的菌株所需底物价格高 且3-ΗΡ产率都比较低，因此长期处于实验室阶段。近年来，随着分子生物学技术的发展，大 量研究开始集中于对天然菌株进行途径改造，利用重组菌以甘油或葡萄糖等廉价碳源为底 物生产3-ΗΡ。基因工程菌的构建按照底物的不同主要分为以葡萄糖为底物和以甘油底物两 种。葡萄糖为底物的转化路线以美国Cargill公司的研究最为成熟，该公司构建了多条从葡 萄糖到3-HP的路径，其中最具有代表性的过程为:葡萄糖经酵解途径到丙酮酸，丙酮酸还原 生成乳酸，乳酸在丙酰辅酶A转移酶的作用下生成乳酰辅酶A，后者在乳酰辅酶A脱水酶作用 下生成丙酰辅酶A，进而在3-羟基丙酰脱水酶的作用下，生成3-羟基丙酰辅酶A，最终生成3-HP〇
[0006] 以甘油为底物生成3-ΗΡ通常有两步反应组成:甘油先在甘油脱水酶及辅酶维生素 Β12的作用下脱水生成3-羟基丙醛(3-ΗΡΑ)，然后3-ΗΡΑ经醛脱氢酶脱氢生成3-ΗΡ，在此过程 需要辅酶NAD+。同以葡萄糖为底物的路径相比，甘油到3-ΗΡ生成途径短，构建和调控更加简 单有效。
[0007] 迄今为止，构建基因工程菌制备3-ΗΡ的研究取得了一定的进展，但是还存在诸多 问题:⑴途径改造本身需要繁琐的分子生物学操作，后期培养往往还需要额外加入抗生素 和诱导剂等，增加操作难度，提高了生产成本;⑵以大肠杆菌为宿主，3-ΗΡ产量相对较高，但 其自身不具有甘油脱水酶酶活，构建过程复杂，并且大肠杆菌自身不能生成甘油脱水酶的 辅酶维生素 B12，需要在发酵体系中额外加入，因其价格昂贵，从而使发酵成本大增;⑶代谢 过程中会产生各种副产物，分离纯化困难;⑷重组菌中甘油脱水酶和醛脱氢酶的活性平衡 问题也影响了 3-HP产量的提高；(5)生成3-HP的过程中，醛脱氢酶的辅因子不能及时生成也 是制约3-HP产量的重要原因。 (三)
【发明内容】
[0008] 本发明目的是针对现有问题，提供了一株敲除菌，用于解除甘油进出细胞的抑制， 同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD+，从而提高3-HP产量。
[0009] 本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明提供一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将甘油脱 水酶基因 dhaB123、甘油脱水酶再激活因子基因 gdrA(甘油脱水酶基因 dhaB123和甘油脱水 酶再激活因子基因 gdrA的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示）、α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体 编码基因 TUkgsadh(核苷酸序列为SEQ ID如.3所示）和甘油三磷酸脱氢酶编码基因8?(11 (核苷酸序列为SEQ ID N0.4所示）导入宿主菌中构建而成;所述宿主菌为敲除甘油抑制因 子基因 glpR(Gene ID:947926)的大肠杆菌（即E.coli W3110_A glpR)，所述α-酮戊二酸半 醛脱氢酶突变体是将α-酮戊二酸半醛脱氢酶(编码基因 kgsadh核苷酸序列为SEQ ID NO. 2 所示)的120位谷氨酸突变为天冬氨酸，219位脯氨酸突变为丙氨酸获得的。
[0011] 进一步，所述甘油脱水酶基因 dhaB123和甘油脱水酶再激活因子基因 gdrA通过重 组质粒pACYCDuet-tac-dhaBl 23-gdrA导入宿主菌中。
[0012] 进一步，所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体基因 TUkgsadh通过重组质粒 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 导入宿主菌中。
[0013] 进一步，所述甘油三磷酸脱氢酶编码基因 gpdl通过重组质粒pCDFDuet-tac-gpdl- TUkgsadh导入宿主菌中。
[0014] 进一步，所述大肠杆菌为E.coli W3110。
[0015] 本发明还提供一种所述生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌在合成3-羟基丙酸中的 应用，具体所述的应用：将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的发 酵培养基中（以甘油为底物），在37°C、150rpm条件下振荡培养至OD600达到0.4~0.8时，向发 酵液中加入终浓度0.01~0.5mM的IPTG，同时加入终浓度5g/L的VB 12，在28 °C、150rpm条件下 诱导发酵，发酵结束，获得含3-羟基丙酸的发酵液;所述发酵培养基浓度组成为:甘油10-30g/L(优选30g/L)，NaCl lg/L，MgS〇4.7H20 0.25g/L，Na2HP〇4.12H20 22.7g/L，KH2P〇43g/ L，酵母膏4g/L，（NH4)2S〇43.2g/L，溶剂为去离子水，pH值为7.00。
[0016] 进一步，优选所述IPTG终浓度为0.0 lmM。
[0017] 进一步，所述重组大肠杆菌在发酵培养前先进行斜面活化和种子培养，所述斜面 活化为:将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基，在 37°C培养16h，获得活化后的重组大肠杆菌;所述种子培养为:将活化后的重组大肠杆菌接 种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的LB液体培养基，在37°C培养10h，获得种子液。 所述种子液按体积浓度6 %的接种量接种至发酵培养基。
[0018] 本发明所述甘油脱水酶基因 dhaB123及甘油脱水酶再激活因子基因 gdrA来自克雷 伯氏菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026。本发明所使用的α-酮戊二酸半醛脱氢酶 (KGSADH)来自巴西固氮螺菌A.brasilense。本发明所使用的甘油三磷酸脱氢酶基因 gpdl来 自酿酒酵母S. cerevisiae。
[0019] 本发明不仅克隆了来自K.penumoniae DSM 2026的甘油脱水酶基因 dhaB123及甘 油脱水酶激活因子基因 gdrA构建重组质粒pACY⑶uet-tac_dhaB123-gdrA，而且还克隆了 A.brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶基因 kgsadh筛选突变体编码基因 TUkgsadh与来自 酿酒酵母的甘油三磷酸脱氢酶编码基因 gpdl构建了重组质粒pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh。
[0020] 本发明所述宿主E.coli W3110,是敲除了控制甘油进出细胞的甘油抑制因子 GlpR，达到加大甘油输入细胞的量，从而加大甘油的代谢，从而提高目的产物3-羟基丙酸的 产量。本发明通过将重组质粒口40￥0〇1161：-七&(3-(111&13123-8(1^和口00?〇1161：-七&(3-8口(11-TUkgsadh导入到E · coli W3110_ Δ glpR中实现3-HP的生产。
[0021] 本发明所述缺失基因的方法采取Red系统同源重组，在本领域技术人员的能力范 围之内。所述重组载体导入重组宿主菌的方法采用化学转化法。
[0022]本发明以大肠杆菌E.coli W3110_AglpR为宿主菌，在合成产物时需要添加适量 的维生素也2;敲除了宿主菌中抑制甘油代谢的相关基因，提高了甘油进入细胞的效率。
[0023] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:通过利用基因敲除技术解除甘油 进出细胞的抑制，同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD+，从而提高3-HP产量，提高了 12倍。 (四）【附图说明】
[0024] 图1.利用甘油合成3-羟基丙酸的代谢途径示意图；
[0025] 图2 ·重组质粒 pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA 构建不意图；
[0026] 图3 ·重组质粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh构建不意图；
[0027] 图4.重组质粒 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 构建不意图；
[0028] 图5.甘油在大肠杆菌中的代谢途径；
[0029]图6. IPTG诱导浓度对重组大肠杆菌中蛋白表达量的影响示意图；（Maker表示标准 蛋白分子量，泳道 1 的菌株为E.coli W3110_A glpR(pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA/ pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh)，0 · 5mM IPTG诱导；泳道2 ~5为菌株E.coli W3110 (pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)，IPTG诱导浓度依次为0、 0·01mM、0 · 25mM及0 · 5mM，泳道6~9为菌株E. coli W3110_Δ glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh)，IPTG诱导浓度依次为0、0 · 01mM、0 · 25mM及0 · 5mM，箭 头指示目的蛋白。）
[0030]图7.重组大肠杆菌发酵合成3-羟基丙酸的高效液相色谱图；（A~D为标准品，E、F 为E · coli W3110(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)发酵产物的不 差检测图和紫外检测图，G、H为 E.coli W3110_A glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/