2-84h ； (2) 取步骤（1)的适量培养液，按10 _4,10 _5,10 _6稀释，涂布于木块上，30°C培养72h ; (3) 挑选菌落大的接种于发酵培养基中，30°C培养72-84h ; (4) 取适量培养液，按10 _4,10 _5,10 _6稀释，涂布于滤纸上，30°C培养72h ; (5) 挑选滤纸被降解掉处的菌落，按1(Τ4,1(Τ5,10 1 希释，涂布于刚果红-CMC双层平 板，30°C培养72h ; (6) 挑出透明圈大的单菌落，做液态发酵实验，测定产纤维素酶能力，选择2-3株酶活 高的做重复实验，获得产量最高的菌株--绿色木霉F4。
[0024] 发酵培养基的配方为：麦麸50g/L，预处理木质纤维素25g/L，微晶纤维素25g/L， 酵母膏 20g/L，KH2P04 0 . 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgS04 0 . 4g/L，ZnS04.7H20 6mg/L，MnS04.4H20 2. 5mg/L，CoCl；； 2mg/L。其中木质纤维素原料为玉米結杆，纤维素38. 2 wt%，半纤维素22. 1 wt%，木质素20. 2 wt%，灰分3. 9 wt%，用粉碎机粉碎至颗粒大小为l-5mm。采用稀酸蒸汽爆 破进行预处理，2wt%的硫酸，干物质浓度30wt%，蒸煮温度190°C，停留时间5min。预处理后 原料干物质中纤维素含量为37. 3wt%，乙酸含量0. 6wt%，甲酸含量0. 5wt%，5-羟甲基糠醛含 量0· 05wt%，糠醛含量0· 03wt%，总酚含量0· 015wt%。
[0025] 刚果红-CMC 双层平板培养基配方为：KH2P04 lg，（NH4)2S04 0 . 7g，MgS04 0 . 3g， CaCl2 0. 15g，0. 5ml Mandel' s营养液，定容到500ml ......记为溶液⑴。
[0026] 下层为200ml溶液⑴中加入4g琼脂。
[0027] 上层为lg CMC，0. lg去氧胆酸钠，O.Olg刚果红，溶于100ml溶液⑴中，加入lg琼 脂。
[0028] 实施例2绿色木霉F4液态发酵产纤维素酶 以上述含抑制物的预处理玉米秸杆为碳源和诱导物，利用绿色木霉F4液态发酵生产 纤维素酶。具体过程如下： (1) 配制液体发酵培养基：麦麸50g/L，预处理玉米結杆50g/L，微晶纤维素25g/L，酵母 膏 20g/L，ΚΗ2Ρ04 0· 25g/L，CaCl2 0· 4g/L，MgS04 0· 4g/L，ZnS04 · 7H20 6mg/L，MnS04 · 4H20 2. 5mg/L, CoCl2 2mg/L ； (2) 将上述培养基置于500mL三角瓶中，121°C灭菌30分钟，冷却后接种绿色木霉F4， 30°C恒温培养24h，转速200rpm，获得种子液； (3) 将上述种子液按10% (v/v)接种量接种到发酵培养基中，30°C发酵72h ; (4) 采用截留分子量大小为5 KD的超滤膜对绿色木霉F4发酵液进行浓缩；将910mL 滤纸酶活为12. 4IU/mL的发酵液浓缩30倍得到30mL浓缩的酶液，浓缩液的滤纸酶活为 365IU/mL，酶活损失仅1. 9%。
[0029] 发酵结束后，经检测发酵液中与纤维素酶解相关的蛋白包括：外切葡聚糖酶 I，内切-1，4_β-木糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，1，4-i3_D-葡聚糖纤维二糖水解酶C， 外切-1，4-β-木糖苷酶，内切葡聚糖酶EG-1，阿拉伯呋喃糖苷酶/B-木糖苷酶，内 切-1，4- β -木糖苷酶C，NAD (Ρ)Η依赖性D-木糖还原酶，内切-1，4- β -木糖苷酶C等。
[0030] 测定FPA、CMC酶活、β -葡萄糖苷酶酶活，酶活测定底物分别采用滤纸、羧甲基纤 维素钠和水杨素。酶活测定使用DNS法：以在50°C，pH5. 0条件下，lmin催化底物水解产 生相当于1 μ mol葡萄糖的还原糖定义为一个国际酶活力单位。水解液中的糖成分，采用高 效液相色谱（HPLC)法分析。
[0031] 酶解得率（％ )=糖液中还原糖总量（g) X0. 9X100/底物中纤维素量（g) 重复4批次的上述三角瓶试验结果表明，滤纸酶活平均达到12. 4IU/ml，CMC酶活平均 为18. 5IU/ml，β -葡萄糖苷酶活平均为1. 7IU/ml。
[0032] 实施例3绿色木霉F4液态发酵产纤维素酶 处理工艺和操作条件同实施例2,不同之处在于：将制备的绿色木霉F4种子液分别接 种到5个相同的培养基中，在发酵24h后，分别加入1. 5g槐树粉、山梨糖、纤维二糖、异麦芽 糖、葡糖酸，再培养72小时。重复进行3个批次，检测不同样品的FPA、CMC酶活、β-葡萄 糖苷酶酶活，如表1所述。
[0033] 表1不同样品的酶活检测结果(单位：IU/ml)
实施例4采用发酵粗酶液酶解预处理玉米秸杆 按照表2的配方在三角瓶中分别加入预处理玉米秸杆（PCS)、0. 05M柠檬酸缓冲液 (pH5. 0)和蒸馏水，采用实施例2制备的浓缩粗酶液进行酶解，酶解的干物质浓度为20%， 130 r/min，50°C振荡酶解72 h，控制酶解体系的总质量为50g，酶加入量为0. 04、0. 05、 0. 06、0. 07、0. 08g/g纤维素。根据最终葡萄糖浓度(单位：％)，计算葡萄糖得率。
[0034] 表2 F4发酵酶液水解PCS试验条件和结果
由表2可见，采用本发明绿色木霉F4菌株制备的纤维素酶液酶解预处理玉米秸杆，耐 受抑制物能力强，还原糖得率高，酶解效果好。
【主权项】
1. 一株绿色木霉F4,其分类命名为绿色木霉（ZricAoofe/TKg Kiriofe)，已于2008年 11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2736〇2. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：绿色木霉F4菌落在PDA平板上25°C培养 4天扩展5-lOcm，初期白色稀疏，后形成绿色产孢区，反面无色；可以在腐木，秸杆，有纤维 素的土壤，马铃薯，玉米粉上生长，生长最适pH值为5. 0-5. 5,生长最适温度25-35°C。3. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：绿色木霉F4是通过富集，木块涂布筛选， 滤纸涂布筛选，刚果红-CMC双层平板筛选得到。4. 根据权利要求1所述的绿色木霉F4在生产纤维素酶方面的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：绿色木霉F4发酵生产纤维素酶的pH值 为3. 0-6. 0,发酵温度为23-35°C，发酵时间为48-120h。6. 根据权利要求1所述的绿色木霉F4在以预处理木质纤维素为培养基碳源和诱导物 发酵生产纤维素酶方面的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：绿色木霉F4发酵生产纤维素酶的发酵 培养基为：麦麸l〇_50g/L，预处理木质纤维素10-60g/L，微晶纤维素5-30g/L，酵母膏 5-30g/L, KH2P04 0. l-10g/L, CaCl2 0. 01-3g/L, MgS04 0 . 01-3g/L, ZnS04· 7H20 0.01-50mg/ L，MnS04· 4H20 0· 01-20mg/L, CoCl2 0·01-50 mg/L。8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述的木质纤维素原料为玉米秸杆， 采用稀酸预处理或稀酸蒸汽爆破预处理。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：稀酸预处理条件为：酸浓度为 0· 5wt%-2. 5wt%，干物质浓度为10wt%-20wt%，温度115-180°C，时间5-120min ;稀酸蒸汽爆 破预处理条件为：酸浓度0. 5wt%-2. 5wt%，干物质浓度25wt%-40wt%，温度150-180°C，时间 5_20min〇10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：预处理木质纤维素挤压脱水后直接加入 到发酵培养基中，挤压脱水后干物质中，木糖含量lwt%-10wt%，纤维素含量30wt%-40wt%， 木质素含量15wt%-18wt%，乙酸含量0· 5wt%-2wt%，甲酸含量0· lwt%-〇. 5wt%，5-羟甲基糠 醛含量 〇· 〇lwt%-〇. 05wt%，糠醛含量 0· 02wt%-0. 08wt%，总酚含量 0· 005wt%-0. 015wt%。11. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：当发酵10-24h后，加入山梨糖、纤维二 糖、槐树粉、异麦芽糖、葡糖酸内脂等的一种或几种，再发酵48-120小时。12. 根据权利要求6至11任一所述绿色木霉F4生产的纤维素酶在酶解预处理木质纤 维素方面的应用，其特征在于：将发酵后粗酶液采用2-50KD超滤膜进行浓缩，浓缩10-200 倍；采用浓缩的酶液对预处理木质纤维素原料进行酶解，酶加入量为〇. 01-0. lg/g纤维素。13. 根据权利要求12所述的应用，其特征在于：控制酶解体系的pH值为4. 8-5. 2,温度 为48-52°C，干物质浓度为5wt%-30wt%。
【专利摘要】本发明公开了一株绿色木霉F4及其应用，其分类命名为绿色木霉（<i>Trichoderma</i><i>viride</i>F4），已于2008年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2736。该菌株在以预处理木质纤维素作为碳源和诱导物生产纤维素酶的过程中，能够耐受预处理木质纤维素引入的多种抑制物，仍然可以高效产酶，分泌的纤维素酶成分全，酶活性高，对预处理木质纤维素底物的酶解适应性强。CGMCC No273620081110
【IPC分类】C12P19/14, C12P19/02, C12N9/42, C12R1/885, C12N1/14
【公开号】CN105647813
【申请号】
【发明人】唐开宇, 张全
【申请人】中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年12月5日