一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置的制造方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种能够快速进行外周血细胞分离的微流体装置，尤其涉及一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置。
【【背景技术】】
[0002]循环肿瘤细胞是从原有肿瘤组织脱落后内渗进入血液循环系统，并随血液在体内循环的肿瘤细胞。尽管人们对癌转移的机理和过程仍缺乏清楚的认识，但循环肿瘤细胞的作用与癌变转移有着直接的联系，已经得到了一致确认。因此，循环肿瘤细胞的数量和形态都可作为患者的病情发展预判依据，如病情的确诊、术后监测、病理学研究等。然而，要从外周血样中获取肿瘤细胞却是非常困难的。主要原因有两个:数量稀少、表面特异分子异构。因此，使用过滤法、梯度离心法、免疫磁珠分选法都无法获得满意的细胞回收率和纯度。
[0003]循环肿瘤细胞的分离过程包含了富集和分离两个方面，需要满足三个要求:大通量处理、识别与捕获、高效释放。大通量处理解决的是目标细胞的数量问题，而准确捕获和释放是获取高纯度细胞的关键。然而，大通量处理与准确捕获也存在矛盾，前者要求细胞快速地流动以提高通量，后者则要求低速流动以提高识别效率。对于细胞识别，存在有标记识别和无标记识别两类，前者需要在对样品进行标记预处理才能用于分离，如磁珠、荧光标记等。后者则无需外加标记物，直接利用细胞自身特性进行操作。因而更符合实际需求。研究结果也证明，采用细胞表面特异分子识别的方法，具有更高的效率和选择性，也代表了技术发展的趋势。
[0004]微流体技术的进步为上述问题的解决提供了新的方向。微流体系统可显著提高细胞与器件结构接触的频率，相应的也提高了被捕获的机率，利用多通道并行处理解决大通量处理与准确捕获之间的矛盾，提高处理效率。利用声表面波和介电泳的驱动方式，已经实现对多种微颗粒的无标记聚集和分离，具有很高的处理效率。然而，对于外周血中循环肿瘤细胞的获取，则需要有全新的设计。
[0005]声表面波驱动效率高，可实现对微小颗粒水平面横向的操纵。介电泳能够在水平面、垂直面内实现微粒操纵，但存在作用力小，效率差的缺点。因此，将二者组合起来使用，相互配合。声表面波用于横向细胞分离，介电泳则与之配合驱动垂直面内细胞移动，解决悬浮细胞不能与识别表面接触的问题。因此，采用组合式场流分离和特异分子亲和识别的两步分离法，可以实现对外周血中循环肿瘤细胞的有效分离。
【
【发明内容】
】
[0006]本发明的目的是提供一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，具有处理通量大、效率高、选择性好的特点，实现对稀有循环肿瘤细胞的快速获取。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0008]一种组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，采用三层式结构，从上而下分别包括上盖板、通道板和基底板;上盖板上加工有流体主入口和两个出口，通道板上制作有微通道，并作为分离腔，三层结构叠加后，流体主入口与微通道一端连通，两个出口与微通道另一端连通，上盖板的下表面上制作有介电泳电极，电极布置方向与微通道倾斜，实现垂直方向和横向的驱动作用，基底板的上表面制作有声表面波换能器，声表面波换能器平行于微通道布置，声波场垂直于流动方向，基底板上还制作有用于细胞捕获的表面结构。
[0009]进一步，基底板上的表面结构，为制作于基底板上表面的纳米粗糙度表面，并利用表面化学改性方法，在其上依次布置有连接体和细胞识别配体。
[0010]进一步，上盖板为玻璃材质，并在其上采用剥离或刻蚀法加工有介电泳用叉指微电极，叉指电极与微通道倾斜布置，利用介电泳力驱动细胞横向和垂直分离。
[0011 ]进一步，通道板为PDMS材质，利用SU-8光刻及模塑工艺制成，其上制作了微通道，通道板并与上盖板、基底板键合成一体，实现微通道封闭。
[0012]进一步，基底板为铌酸锂压电材料，并采用剥离或刻蚀法制作了声表面波驱动的叉指电极。
[0013]进一步，所述连接体包括生物素、链霉亲和素和树形大分子。
[0014]进一步，所述细胞识别配体包括ant1-EpCAM、EGFR和核酸适配体。
[0015]本发明的组合式场流分离的循环肿瘤细胞分离装置，采用声表面波和介电泳驱动的场流分离组合方式，将红细胞从血样中分离出来。再以特异分子识别法从剩余的细胞中捕获循环肿瘤细胞。最后经过释放操纵，即可获得所需的对象。组合式的场流分离方式，可以加快处理速度提高效率，适用于大通量的样品处理。特异性分子识别方法具有很高的选择性，能够获得高纯度的捕获结果。
[0016]该装置可实现对外周血细胞的快速分离，并从中捕获循环肿瘤细胞。改变识别配体的类别，可实现多种类型细胞的识别和捕捉，亦可用于对其他生物对象分离。用于细胞分离时，外周血样通过注射栗、蠕动栗等注入微通道中。调整声表面波的高频信号源，在通道内形成一个稳定的声波场并驱动细胞横向分类聚集。同时对介电泳信号进行调节，使其能在垂直方向上实现细胞驱动。首先被分离出的红细胞经过出口一流出，白细胞群则经过识别区域，最后经由出口二流出。分离结束后，在释放液的作用下，可在出口二收集到循环肿瘤细胞。
[0017]装置采用场流分离和特异分子亲和识别两步分离法，前者将红细胞快速去除，后者则将目标细胞从白细胞混合群中捕获。相比于其他分离法，该装置具有处理通量大、效率高、选择性好的特点，可以实现对稀有循环肿瘤细胞的快速获取，满足病情诊断、细胞分析、病理学研究的需要，并能提高检测分析的实时性和准确性。
【【附图说明】】
[0018]图1为分离装置的原理图
[0019]图2为分离装置的结构分解图
[0020]图中:I上盖板，11流体主入口，12介电泳电极，13出口一，14出口二，2通道板，3基底板，31细胞捕获区，32声表面波换能器。
【【具体实施方式】】
[0021]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
[0022]如图1所示，本发明的分离装置的采用声表面波和介电泳驱动场流分离实现对红细胞的去除。当声表面波垂直于细胞流动方向时，声波场作用下的血细胞按照体积大小不同在横向分别聚集。选择