一种基因编码的环腺苷酸荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因编码的环腺苷酸荧光探针及其制备方法和应用，具体涉及一 种基因编码的环腺苷酸荧光探针、环腺苷酸（CAMP)检测探针的制备方法和上述探针在检 测活细胞内（包括大肠杆菌原核细胞及哺乳动物真核细胞）cAMP水平中的应用。
【背景技术】
[0002] CAMP作为一种信号小分子，广泛存在于从低等微生物到高等哺乳动物的细胞组织 中，由三磷酸腺苷活化腺苷环化酶生成，然后通过激活cAMP依赖性蛋白激酶PKA使靶细胞 蛋白磷酸化，进而调节下游连续性的特异性信号级联反应，从而在细胞内起传递激素和递 质的中介作用，被称为细胞内生命信息传递的的"第二信使"。cAMP在体内的作用几乎遍及 各个组织器官，能够广泛参于包括激素分泌、肌肉收缩、离子通透等在内的细胞代谢活动， 另外在细胞生长与分裂、分化调节、炎症反应、免疫反应、前列腺素作用中都起着重要作用， 因此cAMP本身及其代谢调节所涉及的众多酶类成为了药物设计的靶标。
[0003] 在哺乳动物除红细胞外，所有组织中都有cAMP的分布，但是正常情况下细胞内 cAMP浓度一般低于10-6mol/L，而且在激素或应激作用下腺苷酸环化酶被激活会使cAMP水 平发生急剧变化，变化比例也会随细胞状态不同而有所差异，因此这给cAMP的测定带来极 大不便。较传统的检测手段主要是免疫学方法，最早出现的是放射免疫法（RIA)，利用同位 素标记的与未标记的抗原同cAMP抗体发生竞争性抑制反应，通过研究机体对抗原物质反 应的发生、发展和转化规律进而标定cAMP水平。但该方法存在一个最大的缺陷：其严重的 放射性。之后出现的酶联免疫法（ELISA)缺陷则在于：1、操作步骤较多；2、当使用的cAMP 抗体未经过亲和纯化时其特异性不是很理想；3、在一些组织中，cAMP的含量不是很高，使 用传统的显色或发光方法，最终检测的灵敏度不理想。其他如纸层析法、HPLC分析、荧光成 像等方法也常见于各类文献报道中。然而，大部分方法都存在一定不足，包括检测仪器及试 剂的复杂与昂贵，方法本身的污染性，检测步骤的繁琐等，特别需要指出的是，大部分方法 对单个细胞中祀标分子的灵敏度不足或者是不能进行亚细胞定位，而且最大的缺陷在于检 测时需要对样品进行裂解、分离、纯化等操作，而在一系列繁琐操作中极易引入误差最终显 示的结果与实际存在出入。另外，现有用于活体动物或细胞检测的cAMP探针有以下几种类 型，各自都存在严重缺陷：首先是化学染料荧光探针，此类探针在透膜方面有很大障碍，大 大降低了其利用范围，且其激发波长一般位于紫外区，带来的细胞损伤较大，而且可能会受 到生物样品自发荧光的影响；其次是生物合成荧光探针，此类探针在现有研究报道中主要 表现为FERT模型，个体较为庞大在蛋白表达中易出现折叠问题，同时检测过程中要涉及双 荧光蛋白空间距离的变化，探针的灵敏度及检测限也不理想。
[0004] 因此，本领域亟需发展一种特异性、直观性和灵敏性的cAMP检测技术，特别是一 种适合生物体生理水平和亚细胞水平的特异性cAMP检测技术。
[0005] 相对于传统的小分子化学探针而言，荧光蛋白探针在大多数的活体细胞中实现了 对靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用的标记和分 析，成为许多细胞内分子事件检测的首选模型。
[0006] 绿色荧光蛋白是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白，最早于名为Aequorea victoria的水母中发现，是由238个氨基酸残基组成的单链多肽，基因长达2. 6kD，由3个 外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸，天然GFP蛋白中第65-67位的三个氨基酸 Ser-Tyr-Gly能够自发形成一个焚光生色基团。
[0007] 尽管对野生型GFP的生色团及其发光原理都有了一定程度研究，但其结构及光谱 性质等仍存在较多缺陷，随着对GFP蛋白突变研究的逐渐深入，目前已经发展出许多表现 突出的GFP衍生物，优化后的GFP吸收光谱发生迀移，不但亮度提高，蛋白成熟速度也获得 增加。借助于对GFP蛋白序列的重新排列，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N 端，原1-144位氨基酸部分作为新蛋白的C端，两片段之间通过一小段柔性的短肽链相连， 形成一个对空间变化敏感的环状排列荧光蛋白，在此基础上对原蛋白进行点突变就形成了 环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP。
[0008] 随着荧光蛋白应用日益广泛，相关的一些基于荧光的分析检测方法也得到进一步 发展。例如FRET作为一种荧光能量转移的现象，对于距离和荧光基团的空间取向高度敏 感，很多研究中通过FRET效率的测量来观察一些生物分子的相互作用。现有研究报道利用 基因工程重组数段将期望研究的蛋白基因两端分别于CFP与YFP融合来表达一个新的融合 蛋白，通过荧光的变化直观的表现该蛋白与专一性的靶标分子结合所产生的空间变化。
[0009] 因此，本文所用的荧光蛋白序列可以来自于avGFP及其衍生物，包括但不局限于 这些突变体：黄色荧光蛋白（YFP)，绿色荧光蛋白（GFP)等的序列，其中优选环状排列的黄 色荧光蛋白cpYFP的序列。
[0010] 本文涉及的另一种蛋白，Epac蛋白是一种本领域已知的被cAMP直接激活的交换 蛋白，由881个氨基酸组成，普遍存在于人体各组织中，最早在研究小分子G蛋白Rapl的活 化机制时被发现并分离，可在不同的亚细胞器如细胞核，细胞质，核膜等区域进行表达，其 具体定位主要取决于细胞的类型和细胞周期。Epac结构域包括一个调控区和催化区，除含 有既往GEFs的3个保守区域外，还含有REM和DEP功能区。REM对稳定GEFs结构有重要作 用，DEP功能区参与膜附着。其中关键的是Epac存在一个cAMP结合的疏水性口袋结构域， 该区域存在一些高度保守的序列，可以与cAMP的磷酸基团和核糖基团相互作用。
[0011] 虽然Epac蛋白在结合cAMP分子后其自身会发生明显的构象变化，但该变化并不 能直观的显示出并被外界所捕获，而借助于荧光蛋白这一工具，我们可以很好的融合二者 获得一个全新的基因编码荧光探针，利用Epac蛋白感受生理环境中cAMP水平的变化并将 这一变化传递到荧光蛋白，通过荧光蛋白产生荧光与否及荧光强弱，对机体或者细胞生理 状态进行实时描述。
[0012] 综上所述，我们认为，利用包含Epac蛋白的重组荧光融合蛋白能够满足在生理水 平和亚细胞水平上检测cAMP的急切需要。
[0013] 本文所述参考文献均引入本文。
【发明内容】
[0014] 本发明的第一个目的是提供一种基因编码的cAMP荧光探针。
[0015] 本发明的第二个目的是提供一种包含编码基因编码的cAMP荧光探针的核苷酸序 列。
[0016] 本发明的第三个目的是提供一种基因编码的cAMP荧光探针的制备方法。
[0017] 本发明的第四个目的是提供一种包含基因编码的cAMP荧光探针的融合蛋白。
[0018] 本发明的第五个目的是提供一种包含编码含有cAMP荧光探针的融合蛋白的核苷 酸序列。
[0019] 本发明的第六个目的是提供一种包含编码cAMP荧光探针核苷酸序列的表达载 体。
[0020] 本发明的第七个目的是提供一种包含本发明所述表达载体的宿主细胞。
[0021] 本发明的第八个目的是提供一种基因编码的cAMP荧光探针在检测cAMP中的应 用。
[0022] 本发明的第九个目的是提供一种所述的荧光探针在监测活细胞内环核苷酸的变 化的应用。
[0023] 本发明的第十个目的是提供一种所述的荧光探针在高通量筛选过程中的检测方 法。
[0024] 本发明的第十一个目的是提供一种试剂盒，其包含本发明所述的基因编码的cAMP 荧光探针和说明书。
[0025] 本发明的技术方案如下：
[0026] -种基因编码的cAMP荧光探针，其内含有荧光蛋白序列或其衍生物和对cAMP敏 感的多肽，其中所述对cAMP敏感的多肽，
[0027] (1)具有cAMP结合特性的CNBD结构域；和/或
[0028] (2)来源于对cAMP敏感的被cAMP直接活化调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子Epac家 族蛋白。
[0029] 所述具有cAMP结合特性的CNBD结构域为序列表所示Epacl-CNBD氨基酸序列或 Epac2B-CNBD氨基酸序列。
[0030] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，所述对cAMP敏感的多肽为来自于真 核生物的交换因子Epac蛋白基因的多肽，该多肽的序列选自SEQ ID N0 :1、2、3和4。
[0031] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，所述荧光蛋白序列为环状排列的黄 色荧光蛋白cpYFP如SEQ ID N0 :21所示。
[0032] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，所述荧光探针所包含的荧光蛋白序 列B和对cAMP敏感的多肽中具有cAMP结合特性的CNBD结构域A，所述B为序列表所示B1 和/或B2氨基酸序列，所述A为序列表所示A1和/或A2氨基酸序列；所述荧光探针的组 合形式是：
[0033] (l)A-B-A，其中B插入A的柔性区域内，将A分割成A的第一部分和A的第二部分， A的第一部分和A的第二部分共同构成完整的A结构域；
[0034] (2)A1-B-A2,其中A1和A2分别串联在B两端，A1和A2前后顺序可变换；A1是来 自于人体或小鼠组织器官的交换蛋白或其衍生物的氨基酸序列，A2是来自于人体或小鼠组 织器官的另一交换蛋白或其衍生物的氨基酸序列。
[0035] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，优选的是，将cpYFP插入到Epac2B，插 入位点分别为 P/D (23/24)、H/L (58/59)、N/T (162/163)或 Q/D (171/172);将 cpYFP 插入到 Epacl，插入位点为 K/T (162/163)。
[0036] 所述的cAMP荧光探针优选SEQ ID NO :5、6、7、8、39、40、41、42、67所示的蛋白序 列。
[0037] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，所述荧光探针为具有以下结构：
[0038] A1_A2_LK1 _FP_LK2_A3_A4?
[0039] 其中，六1是Epac蛋白的第一结构域，优选来源于人体组织的Epacl蛋白的氨基酸 序列的氨基酸110-186如SEQ ID N0:13所示或人体组织的Epac2蛋白的氨基酸序列的氨 基酸 216-291 如 SEQ ID N0:14 所示；
[0040] A2是Epac蛋白的第二结构域，优选Epacl蛋白的氨基酸序列的氨基酸245-363,如 SEQ ID N0:15所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸356-476,如SEQ ID N0:16所示；
[0041] 六3是Epac蛋白的第三结构域，优选Epac 1蛋白的氨基酸序列的氨基酸384-518，如 SEQ ID N0:17所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸496-634,如SEQ ID N0:18所示；
[0042] A4是Epac蛋白的第四结构域，优选Epacl蛋白的氨基酸序列的氨基酸662-889， 如SEQ ID N0:19所示或Epac2蛋白的氨基酸序列的氨基酸772-1009,如SEQ ID N0:20所 示；
[0043] FP是荧光蛋白，选自GFP，YFP，CFP以及基于这些蛋白的变异体，优选YFP，更优选 cpYFP 如 SEQ ID N0:21 所示；
[0044] L&可以存在或不存在，存在时，1^1为1\六、3、6中一种或一种以上氨基酸；
[0045] LK2可以存在或不存在，存在时，LK2SG、S、T中一种或一种以上氨基酸。
[0046] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，优选的是，所述cAMP荧光探针为对荧 光蛋白序列和对cAMP敏感的多肽的连接处氨基酸肽段YNSD和LEYN进行截短的突变体。
[0047] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，进一步优选的是SEQ ID N0:51-66和 SEQ ID N0:68-83所示的氨基酸序列。
[0048] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，优选的是，所述cAMP荧光探针为对 cAMP荧光探针进行定点突变的突变体，所述突变为在Epac2B-CNBD氨基酸序列的93位、105 位、122位、123位、132位、133位、152位、156位、160位、412位上突变。
[0049] 根据本发明所述基因编码的cAMP荧光探针，进一步优选的是SEQ ID N0:110-126 所示的氨基酸序列。
[0050] 本发明还提供一种编码所述荧光探针的核苷酸序列，包括编码对cAMP敏感的蛋 白质的核苷酸序列和编码荧光蛋白的核苷酸序列。
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