加入到酶标板上， 37°C作用45min;用PBST以200ul/孔清洗3遍； 显色：每孔加入l〇〇ul的TMB显色液(临用前配）；37°C孵育15min; 终止反应:每孔加入l〇〇ul的2M H2S〇4以终止反应； 读数:在酶标仪上测定〇D450nm读数;分析所得数据，一般ELSIAM). 3认为是阳性，如果 阳性值较多的，则会从高挑选，一般会选ELSIA> 1.0的阳性值。结果筛选出46个阳性细胞株； 对其中8个利用WesternBlot检测方法进一步筛选多克隆细胞株，根据结果选择条带最亮的 6个细胞株进行挑选单克隆细胞株。
[0027] 4单细胞克隆株的筛选 4.1单克隆细胞株的ELSIA检测 ELISA检测方法同3.2。
[0028]结果筛选出31个阳性细胞株;对其中9个利用Western Blot检测方法进一步筛选 单克隆细胞株，根据结果选择条带最亮两个单克隆细胞株制备腹水。
[0029] 4.2单细胞克隆株的亚型分析 包板：用Coating buffer稀释抗原至lug/ml，以50ul/孔的量铺到酶标板上，轻轻振摇 使包被液铺满孔底，4°C包被过夜;次日弃去包被液，用TOST以200ul/孔洗1遍，在吸水纸上 拍干;封闭：以60ul/孔加入1%BSA，37°C封闭lh;将稀释好的羊抗鼠分型二抗以50ul/孔加 入到酶标板上，37°C作用lh;用PBST以200ul/孔清洗2遍;加二抗：用1%BSA稀释羊抗鼠 HRP 二抗1:10000稀释，以50ul/孔加入到酶标板上，37°C作用45min;用TOST以200ul/孔清洗3 遍；显色：每孔加入100ul的TMB显色液（临用前配）；37°C孵育15min;终止反应:每孔加入 100ul的2M H2S〇4以终止反应;读数:在酶标仪上测定0D450nm读数;结果发现A5-E10单克隆 细胞株为 IgG2a，icchain。
[0030] 杂交瘤细胞株A5-E10，已于2016年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为CCTCC N0:C2015218。
[0031] 4.3单细胞克隆株的腹水效价分析 ELISA检测方法同3.2。
[0032]结果发现将腹水稀释比例为1:240000时的吸光值都大于1。
[0033] 5单抗纯化 取4只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后取杂交瘤细胞(效价较高同时细胞状 态好)重悬于无血清培养基中，按1 X 1〇6个细胞/0.5ml/只量注射石蜡小鼠，注射细胞约7-14d后收集腹水。用50mM PBS预处理protein G亲和层析柱;将腹水样品上柱，收集流穿液； 加入PH3.0、0.1M甘氨酸-HC1洗脱，通过SDS-PAGE胶检测纯化后抗体的纯度。结果表明，通 过protein G亲和柱纯化的抗体，其效价高于1:10000(表1)。
[0034]表1单抗效价分析
实施例2锦鲤疱疹病毒间接ELI SA检测方法的建立 1.抗原工作浓度的确定 将纯化的锦鲤疱疹病毒用包被液(PH8.6)稀释为50yg/mL、30yg/mL、10yg/mL浓度梯 度，包被96孔酶标板，每孔加入100uL，4°C湿盒包被过夜。每孔加入300 yL 10%的脱脂乳进 行封闭，37°C温箱中孵育1 h，用TOST洗涤3次，每次3-5 min。将抗KHV阳性血清、锦鲤阴 性血清进行1:300倍稀释，每孔加入100 uL进行ELISA方阵试验，37°C温箱中孵育1 h，用 PBST洗涤3次，每次3-5 min。将上述制备的鼠抗锦鲤IgM抗体1:2000，每孔100此，37°(：温 箱中孵育lh，用PBST洗涤3次，每次3-5 min。加入50 yL显色底物(TMB)，37°C避光显色10 min。用50 yL 2mol/L H2SO4终止反应。测定各孔OD45〇nm值，确定抗原工作浓度。
[0035]方阵滴定结果表明，当抗原包被浓度为50yg/mL P/N值最大，阳性血清0D45Qnm值高 于1. 〇，阴性血清〇D45〇nm值小于0.2。因此，确定抗原的最适包被浓度为50 yg/mL。
[0036] 2.最佳封闭液和封闭时间的确定 分别选择1%脱脂奶粉、2.5%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、10%脱脂奶粉和1% BSA为封闭液进 行封闭试验。选择最佳封闭液在37°C温箱中分别封闭30min、60min、90min、120min，确定最 佳封闭时间。
[0037]结果表明，用10%脱脂奶粉作为封闭液的P/N值最高，而且阳性血清0D45Qnm值大于 1.0，阴性血清0D45Q?值小于0.2，封闭效果最好。在37°C条件下封闭60min时P/N值最高。 [0038] 3.锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法的建立 (1)包被:采用包被液将纯化的KHV病毒稀释到50yg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100 yL，4°C湿盒包被过夜。
[0039] (2)封闭：每孔加入300 yL 10%的脱脂乳进行封闭 (3)样品准备：用一次性注射器采取锦鲤血液，置于离心管中，于室温下凝固，先于37°C 下放置2h，再于4°C放置过夜，待血清充分析出后，3000g/min离心10min,取其上清，作为 检测样品。
[0040] (4)加样:将上述步骤(5)制备的检测样品用roST(pH7.4)按1:300进行稀释，将稀 释好的样品按?〇〇μL7孔的量加入上述步骤封闭好的酶标板中。
[0041 ] (5 )温育：用封板膜封板后置37 °C温箱中孵育1 h。
[0042] (6)洗涤:将样品从每个孔中吸出，用PBST洗涤3次，每次3-5 min。
[0043] (7)鼠抗锦鲤IgM抗体的稀释:将鼠抗锦鲤IgM抗体用PBST(pH7.4)作1:2000稀 释。
[0044] (8)加入鼠抗锦鲤IgM抗体:将稀释好的鼠抗锦鲤IgM抗体按100 uL/孔的量加入 上述步骤(6)中洗涤好的酶标板中。
[0045] (9)温育：同步骤(5); (10) 洗涤：同步骤(6); (11) 酶标二抗的稀释:将酶标二抗用roST(pH7.4)作1:5000稀释。
[0046] (12)加入二抗:将稀释好的酶标二抗按lOOyL/孔的量加入上述步骤(10)中洗涤好 的酶标板中。
[0047] (13)温育：同步骤(5); (14) 洗涤：同步骤(6); (15) 显色：加入新鲜配制的底物溶液(TMB: H2〇2=l: 1) 50μ!7孔，用封板膜封板后置37 °〇避光显色lOmin。
[0048] (16)终止:加入50uL/孔2M的H2S〇4终止液，终止反应。
[0049] (17 )测定:采用波长450nm的酶标仪测定0D值。
[0050] ( 18)结果判断:0D45Qr?2 0 · 20时判定为阳性 以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明 精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【主权项】
1. 一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，其可特异性识别锦鲤免疫球蛋白IgM，效 价高于1:10000。2. 根据权利要求1所述的抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，其特征在于，所述单克 隆抗体由保藏编号为CCTCC N0:C2015218的杂交瘤细胞株分泌产生。3. -株杂交瘤细胞株，已于2016年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 为CCTCC N0:C2015218。4. 权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备用于检测锦鲤免疫球蛋白IgM的免疫检测工 具中的应用。5. 权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备用于检测锦鲤疱疹病毒的免疫检测工具中 的应用。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具包括试剂、试剂盒、 芯片或试纸。7. -种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测试剂盒，其包括权利要求1或2所述的单克隆抗体。8. 根据权利要求7所述的锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂 盒中还包括:包被液、标准血清、洗涤液、HRP标记羊抗鼠抗体、TMB显色液和终止液。9. 一种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法，包括如下步骤： (1) 加样:将待检样品加入包被有KHV病毒的酶标板中； (2) 温育：用封板膜封板后置36~38°C温箱中孵育 (3) 洗涤:将样品从每个孔中吸出，用PBST洗涤； (4) 加入鼠抗锦鲤IgM抗体:将稀释好的权利要求1或2所述的单克隆抗体加入上述步 骤(3)洗涤好的酶标板中； (5) 温育、洗涤，同步骤(2)和(3); (6 )加入二抗:将稀释好的HRP标记羊抗鼠抗体加入上述步骤(5 )中洗涤好的酶标板中； (7) 温育、洗涤，同步骤(2)和(3); (8) 显色:往反应孔中加入TMB显色剂，36~38°C避光显色； (9) 测定及结果判断。
【专利摘要】本发明公开了抗锦鲤IgM的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。所述抗锦鲤IgM的单克隆抗体是由保藏编号为？CCTCC？NO：C2015218？的杂交瘤细胞株A5-E10分泌产生的。利用所述的单克隆抗体可以用于锦鲤或普通鲤鱼某病原或水产疫苗特异性抗体的检测，从而进行疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对锦鲤或普通鲤鱼疾病流行病学调查、病原诊断具有较高的临床使用及推广价值，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。CCTCC NO: C201521820160114
【IPC分类】C07K16/42, C12R1/91, G01N33/569, G01N33/577, C12N5/20
【公开号】CN105646715
【申请号】
【发明人】李莹莹, 王庆, 曾伟伟, 王英英, 刘春 , 郑树城, 石存斌, 宋新建, 黄琦雯
【申请人】中国水产科学研究院珠江水产研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月19日