[0071] 1、GLW2基因过表达表达载体构建
[0072] 本实施例采用表达载体PHB(Mao等，2005，PNAS102:12270-12275，可商购）作为水 稻转基因的载体。该载体编码一个细菌复制起点（ori)、卡那霉素抗性基因（Karf)、潮霉素 抗性基因（HygO、除草剂抗性基因（Baf)、2 X 35S启动子、N0S基因终止信号序列以及用于连 接目的片段的多克隆位点(MCS)。在限制性内切酶位点可插入GLW2基因或其片段构建成转 基因质粒。
[0073] 以正常野生型IR24品种的RNA为模板，合成第一链cDNA，用该GLW2基因0RF序列的 5'和3'端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4)，用高保真酶进行扩增，获 得约1185bp的GLW2基因的全长cDNA扩增产物。将该扩增产物通过重组克隆方法重组进载体 pHB中，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为PHB-GLW2。其中GLW2基因的 表达由自身启动子驱动。
[0074] 5'端的寡核苷酸序列3为(SEQ ID N0.3):
[0075] 5'-gtctctctctcaagcttggatcc ATGGCGATGCCGTATGCCTCC-3'
[0076] 3'端的寡核苷酸序列4为(SEQ ID N0.4):
[0077] 5'-tctagaggatcaattcgagctc TCAGTCACCATTAGTTGATCGAG-3'
[0078] 2、GLW2敲除载体构建
[0079] 利用CRISPR/Cas9系统构建载体，载体名称为BGK03(百格生物技术公司购买），载 体结构示意图如图1所示。采用水稻U6启动子，能够高效的用于单子叶植物，特别是水稻;采 用加强型玉米UBI启动子，高效表达Cas9蛋白；CaMV 35S启动子表达潮霉素抗性基因。
[0080] 首先设计并生成gRNA靶点序列。识别序列一般选择19bp，例如选择靶点序列 GCTCATATACAAGTACCTGGTGG(下划线部分的TGG为PAM序列），然后设计靶点序列（SEQ ID N0.5)和(SEQ ID N0.6)，将合成的引物加水溶解至ΙΟμΜ，按下列反应体系混合后，95°C加热 3分钟，然后以约0.2°C/秒缓慢降至20°C (推荐采用PCR仪）。最后在酶的作用下将上步反应 中生成的引物二聚体构建入载体BGK03，构建好的载体名称为BGK03-GLW2。
[0081 ] 5'端的寡核苷酸序列5为(SEQ ID N0.5):
[0082] 5 '-TGTGTGCTCATATACAAGTACCTGG-3 '；
[0083] 3'端的寡核苷酸序列6为（SEQ ID N0.6):
[0084] 5 '-AAACCCAGGTACTTGTATATGAGCA-3 '；
[0085] 3、GLW2基因转化水稻试验
[0086] 将上PHB-GLW2和BGK03-GLW2通过冻融法导入农杆菌EHA105。农杆菌EHA105平板(4 °C保存)挑取单菌落于YEP液体培养基(Km和Rif各50mg/L)中，28°C振荡培养12~18h，然后 取1~5mL菌液接到100mL YEP液体培养基(含乙酰丁香酮100μ mol/L)中，振荡培养4h后测0D 值稀至相应浓度(0D = 0.5)。将新鲜菌液于8000印111、4°(：、51^11收集菌体，并重悬于三分之一 提及的AAM培养基中。加入放有生长旺盛的胚性愈伤组织的灭菌三角瓶中浸泡25min，再吹 干表面菌液，将愈伤组织转接于共培养基上，28°C暗培养2~3d。共培养愈伤组织经无菌水 和含Cef 500mg/L的无菌水漂洗后，在工作台上吹4h左右，转接于预培养基中28°C暗培养5 ~7d。将预培养的愈伤组织转接于含Hyg和Cef的筛选培养基上继续培养3~4周，再将抗性 愈伤组织转接于仅含Hyg的筛选培养基上，筛选1~2次。取抗性愈伤组织转接于分化培养基 上，28°C光照分化。分化小苗转接于生根培养基，28°C光照培养3~4周，开放培养炼苗7d左 右，最后移栽到大田。
[0087] 获得的再生植株移栽成活后用除草剂或潮霉素筛选转化植株;阳性植株提取叶片 总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因 T1代调查育性表型，验证GLW2基因功能。
[0088] 实施例2 GLW2基因功能分析
[0089] 如实施例1所述的方法获得水稻GLW2过量表达的转基因植株，分为2组，分别命名 为0Ε1-2、0Ε2-3，以及正常对照组control，用转基因 T1代植株观察水稻籽粒表型，结果如图 3~7所示，其中，图4~7中，林为在0.01水平上显著NS为无意对照）。
[0090] 从图中可以看出，转GLW2过量表达基因的植株籽粒粒长、粒宽和千粒重较对照有 显著增加。表明GLW2过量表达会增加籽粒粒长、粒宽，进而导致千粒重增加。
[0091 ]如实施例1所述的方法获得水稻GLW2敲除的转基因植株，分为4组，分别命名为 Κ01-1、Κ01-2、Κ01-5以及K02-3，WT为野生型材料，用转基因 T1代植株观察水稻籽粒表型，其 中，GLW2敲除植株敲除位点如下表3所示：
[0092]表3 GLW2敲除植株敲除位点分析 [0093]
[0094] 结果如图8~11所示，图8中NIL-527R为背景的近等基因系，图9~11中，林为在 0.01水平上显著。从图8~11可以看出，GLW2基因编辑后的植株的籽粒粒长、粒宽和千粒重 较对照有显著降低。表明GLW2敲除会降低籽粒粒长、粒宽，进而导致千粒重降低。
[0095] 从上述分析可以看出，GLW2可以控制水稻籽粒粒长、粒宽，进而影响水稻产量，上 调该基因表达有利于植株籽粒粒长、粒宽增加，下调该基因表达则降低植株的籽粒粒长、粒 宽。
[0096] 实施例3 GLW2基因突变的表型(GLW2位自然突变材料）
[0097] GLW2基因突变后的水稻品种307R(保存于四川农业大学水稻研究所资源中心），经 表性分析和统计分析表明，307R籽粒相比于现有的正常水稻品种527R、IR24以及M63而言， 其粒长、粒宽及千粒重较其他水稻材料有显著增加(图12和表4)。
[0098] 表4正常水稻品种和307R完熟籽粒考种值统计
[0099]
[0100] 相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明水稻粒型控制 基因(GLW2)为水稻等植物的籽粒粒型调控提供新的技术途径;GLW2基因在去除转基因成分 影响方面具有广泛的应用前景;该基因可以显著提高水稻产量，在水稻杂种优势利用中具 有广泛的应用前景。
[0101] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种水稻粒型相关蛋白GLW2，其特征在于，具有如SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列； 或为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的具有同等功能的氣基酸序列。2. 权利要求1所述的水稻粒型相关蛋白GLW2的编码基因，其特征在于，该编码基因的核 苷酸序列为:具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;或，在严格条件下与SEQ ID NO.1所示 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。3. 如权利要求2所述的水稻粒型相关蛋白GLW2的编码基因，其特征在于，所述严格条件 为0 · 2 X SSC，0 · 1 % SDS，60 °C ;或50 % (V/V)甲酰胺，0 · 1 % 小牛血清/0 · lFico 11，42 °C。4. 含有权利要求2或3所述的编码基因的表达载体。5. 如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括PHB、BGK03。6. 含有权利要求2或3所述的编码基因，或含有权利要求4或5所述的表达载体的宿主细 胞。7. 权利要求1所述的水稻粒型相关蛋白GLW2在控制水稻籽粒粒长、粒宽的改良、提高水 稻产量中的应用。8. 权利要求2或3所述的编码基因在控制水稻籽粒粒长、粒宽的改良、提高水稻产量中 的应用。9. 权利要求1所述的水稻粒型相关蛋白GLW2在制备转基因植株中的应用。10. 权利要求2或3所述的编码基因在制备转基因植株中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种水稻粒型相关蛋白GLW2及其编码基因与应用，该GLW2蛋白具有如SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列，或为SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列；该编码基因具有如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，或在严格条件下与SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明GLW2编码基因重组在表达载体并转化水稻后，过表达GLW2能够增加水稻籽粒粒长、粒宽，提高水稻产量。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00, C07K14/415
【公开号】CN105646684
【申请号】
【发明人】李双成, 李平, 高烽焱, 王世全, 邓其明, 郑爱萍, 朱军, 刘怀年, 王玲霞
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月8日