例2转化大肠杆菌BL21
[0073] 吸取ΙμL质粒加入100μΙ BL21感受态细胞中，冰浴30min;
[0074] 42 Γ 热激 90s;
[0075] 冰浴 2min;
[0076] 在超净台内加入900μ1无抗性的LB培养液；
[0077] 37°C180rpi4§lh;
[0078] 吸取100μΙ菌液涂卡那抗性LB平板，37°C过夜培养。
[0079]实施例3大量诱导表达
[0080]挑菌:挑取单克隆至50ml卡那抗性LB培养液中，37°C过夜培养；
[00811转接:按1:100比例转接菌液至500ml卡那抗性LB培养液，共摇3.5L，37°C220rpm培 养 2-2.5h 至 0D6(x)值到 0.6;
[0082]诱导：菌液0D_值到0·6后，加入500μ1 IPTG(IM)至IPTG终浓度为lmmol/L，37°C 220rpm诱导培养4h;
[0083] 菌体收集:菌液6，000rpm离心10min，收集菌体;用40ml PBS清洗菌体，6，000rpm离 心10min，收集菌体，置于-20°C保存；
[0084] 实施例4镍柱亲和层析纯化重组α-溶血素蛋白
[0085]菌体破碎：用裂解液（50mM NaH2P〇4,500mM NaCl，0 · ImM PMSF，lOmM Benzamideme， 0.01 %NaN3，pH 8.0)重悬菌体，用注射器将菌体吹打均匀，避免块状沉淀物产生；用细胞破 碎机Avestin裂解菌液，破碎后离心菌体，取上清；
[0086] 结合:取适量Ni-agarose Beads加入到上清液，摇床上混勾结合30min;
[0087] 4,000rpm 4°C离心5min，收集上清Flow through部分，Beads部分进行下一步；
[0088] 洗涤:裂解液中加入咪唑，咪唑终浓度为5mM，配制得到Wash Buffer。取适量Wash Buffer加入到Beads中，缓慢摇5min，4,000rpm 4°C离心5min，重复洗一次；
[0089] 洗脱：用洗脱液（lOmM NaH2P〇4，150mM NaCl，0.1mM PMSF，10mM Benzamideme， 0.01 %NaN3，pH 7.4)配制50mM、100mM、150mM、200mM和250mM的咪唑洗脱液，每次用5ml咪唑 洗脱液进行洗脱，每个浓度进行3次洗脱；
[0090] SDS-PAGE分析:凝胶浓度：12%，样品点样量为10yl，Marker点样量为5μ1;蛋白纯 化结果如图4所示。
[0091] 实施例5Resource S柱纯化镍柱纯化洗脱部分(50mM到250mM咪唑洗脱部分）
[0092] (l)AKTA 柱平衡；
[0093] (2)镍柱纯化洗脱部分浓缩:将镍柱纯化洗脱部分(50mM到250mM咪唑洗脱部分)进 行超滤浓缩，浓缩后体积约为1.5-2ml;
[0094] (3)样品瞬间稀释:准备一个100ml烧杯，烧杯中加入适量Buffer A(10mM NaH2P〇4， pH 6.0)，再将步骤(2)中浓缩的蛋白样品加到BufferA中，轻轻吹打均匀，终体积为30ml;
[0095] (4)过滤:将步骤(3)的样品过0·45μπι滤器；
[0096] (5)上样：用50ml注射器吸取样品液，尽量赶掉针筒注射器中的气泡，将样品缓慢 注射进入AKTA样品柱；
[0097] (6)洗脱：
[0098] 1)上样:根据样品体积设定，流速2ml/min;
[0099] 2)Flowthrough 收集 5-10ml/fraction;
[0100] 3)洗脱未结合的蛋白：20CV，5_10ml/fraction;
[0101] 4)盐浓度洗脱：0-60%Buffer B(10mM NaH2P〇4,500mM NaCl，pH 6.0)，60CV，2ml/ fraction；
[0102] 5)60%-100%Buffer Ba〇CV,2ml/ffaction；
[0103] 6)100%Buffer B，10CV，不收集；
[0104] 7)100%BufferA，10CV，不收集，结束程序。
[0105] SDS-PAGE分析:选取出峰位置对应的样品收集管，每管吸取16μ 1到新的1.5ml EP 管中，用于SDS-PAGE分析，结果如图5所示。
[0106] 浓缩：根据SDS-PAGE结果收集蛋白，混匀后进行超滤浓缩，用蛋白保存液（PBS， 10 %甘油，pH 7.4)更换三次Buffer，α-溶血素浓度为3.5mg/ml，分装保存于-80 °C。
[0107] 实施例6重组α-溶血素蛋白亚单位疫苗制备
[0108] 按照实验需要，计算疫苗溶液各成分的量，使疫苗中重组α-溶血素蛋白终浓度为 25μg/ml，其中重组α-溶血素蛋白与佐剂ISA 206VG体积比为46:54;
[0109] 将稀释混匀好的重组α-溶血素蛋白溶液及ISA206VG佐剂放置在恒温水浴锅内加 热至32°C ±1°C，待温度稳定后将抗原加入到佐剂管中，震荡器震荡10min进行预乳化；
[0110] 将预乳化完的疫苗放置于盛满冰的烧杯中，固定在预先处理好的超声波细胞破碎 仪上进行乳化；
[0111] 乳化结束后，观察乳化效果:取部分疫苗置于离心管中，3，OOOrpm离心15min，疫苗 不分层为合格；
[0112] 检测合格的疫苗分装到15ml离心管中，标记，封口膜封口，置于4°C保存。
[0113] 实施例7小鼠免疫实验
[0114] 将疫苗拿到室温(25 °C)放置2h左右，使疫苗温度恢复到常温；
[0115] 给小鼠称重、分组并标记，一组为免疫试验组(n = 6)，免疫α-溶血素亚单位疫苗； 另一组为对照组(η = 6)，免疫PBS，并记录数值；
[0116] 用lml注射器吸取lml疫苗，注意将气泡排尽；然后用75%酒精棉球给后腿肌肉消 毒，在肌肉块中部进针，左右后腿各注射50μ1疫苗。
[0117] 实施例8小鼠免疫后攻毒实验
[0118] 挑取SA单菌落(菌株为本实验室保存的CQ339菌株)于5ml液体肉汤培养基中中， 220rpm、37°C摇菌过夜；
[0119] 按百分之一的体积（lml)将摇过夜的细菌接种于100ml新鲜液体肉汤培养基中， 220rpm、37°C摇菌过夜；
[0120] 将100ml菌液装入到500ml离心瓶中，8，OOOrpm离心10min，吸去培养基，菌体用 100ml PBS重悬，重复上述步骤3次，最后将所有的菌体用5ml PBS重悬混匀；
[0121 ]将菌液做10，000倍稀释后计数。根据菌液的浓度，将原菌液稀释到1.5 X 108CFU/ ml(2M LDso)；
[0122] 给免疫组和对照组小鼠称重，一组为免疫试验组(n = 6)，另一组为对照组(n = 6) 记录数值；
[0123] 用lml注射器吸取菌液，按照各浓度细菌对应的小鼠进行尾静脉注射，注射量为 200yl/20g小鼠。
[0124] 连续观察小鼠的生存状况，记录每一只小鼠的死亡时间：早中晚各检查一次;攻毒 后小鼠存活率结果如图7所不。
[0125] 实施例9ELISA检测α-溶血素抗体效价
[0126] (1)包被:用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)稀释纯化的检测用蛋白至0.5yg/ ml，在酶标板上每孔加入100μ1，封口膜封好后4°C冰箱放置过夜；
[0127] (2)洗涤:从冰箱取出酶标板后，放入洗板机中洗涤，洗涤液用PBST;
[0128] (3)封闭：每孔加入200μ1封闭液(5%脱脂奶），封口膜封好后37°C孵育2h;
[0129] (4)样品准备:按已知的信息和需要用量，用封闭液将血清进行适度稀释；
[0130] (5)洗涤：同（2);
[0131] (6)加样:加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37°C孵育lh;
[0132] (7)洗涤：同（2);
[0133] (8)加二抗:每孔加入适度稀释的HRP标记的二抗100μ1，37 °C孵育0.5h;
[0134] (9)洗涤：同（2);
[0135] (10)显色:避光条件下每孔加入100μ1的TMB显色液，37 °C孵育lOmin;
[0136] (11)终止:每孔加入50μ1终止液(2M的H2S〇4)，终止反应；
[ΟΙ37] (12)检测:于450nm波长测定样品0D值，分析数据；
[0138] (13)结果分析:判断抗体阳性的标准:P/N 2 2.1，0D450 2 0.1。
【主权项】
1. 一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用，其特征在于：1) 金黄色葡葡球菌保护性抗原蛋白α-溶血素的定点突变与克隆;2)重组α_溶血素蛋白的表达 与纯化;3)将重组α_溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球 菌乳房炎重组亚单位疫苗。2. 权利要求1所述的金黄色葡萄球菌保护性抗原蛋白α-溶血素，其特征在于： (a) 由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质； (b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有金黄 色葡萄球菌保护性抗原蛋白α-溶血素抗原性的由(a)衍生的蛋白质； (c) 重组α-溶血素蛋白表达系统包括但不限于大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞以及昆虫 细胞等。3. 权利要求1所述的奶牛金黄色葡萄球菌α_溶血素亚单位疫苗的制备方法，其特征在 于包括如下步骤： 1) 将金黄色葡萄球菌溶血素蛋白的第35位的组氨酸定点突变为丙氨酸； 2) 将定点突变的α-溶血素蛋白基因克隆到PET28a载体中； 3) 将步骤2)获得的表达载体转化E.coli BL21(DE3)，诱导表达获得重组α-溶血素蛋 白； 4) 使用镍柱亲和层析和Resource S柱纯化步骤3)得到的重组α-溶血素蛋白； 5) 将纯化得到的重组α_溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂（如ISA 206VG佐剂)充分混 匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。4. 权利要求1所述的亚单位疫苗在预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用。目的在于提供预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白的第35位的组氨酸定点突变为丙氨酸；2)将定点突变的α-溶血素蛋白基因克隆到pET28a载体中；3)将步骤2)获得的表达载体转化E.coli？BL21(DE3)，诱导表达获得重组α-溶血素蛋白；4)使用镍柱亲和层析和Resource？S柱纯化步骤3)得到的重组α-溶血素蛋白；5)将纯化得到的重组α-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。
【IPC分类】A61K39/085, C07K14/31, A61P15/14
【公开号】CN105646681
【申请号】
【发明人】钱泓, 吴有强, 宣春玲, 查银河, 贾宝琴, 曹珊珊, 陈藻
【申请人】浙江海隆生物科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月21日