[0030] 实施例2
[0031] 利用ClustalX2.1软件将实施例1中预测得到的四种抗原多肽分别同流感病毒亚 型H1~H16血凝素蛋白氨基酸序列进行多重序列比对，结果多肽A具有更好的H7亚型特异性 (图2)。所以，将抗原多肽A作为本发明试剂盒的首选。
[0032] 实施例3
[0033]利用(：1130 4.3.1软件分析!17湘禽流感病毒血凝素蛋白的三维结构（？08 10: 4N5J)，发现预测的四个B细胞抗原表位均位于HA蛋白表面，与抗原表位位于蛋白表面的特 点相符（图3)。
[0034] 实施例4
[0035] 1、预包酶标板的制备:人工合成抗原多肽A(氨基酸序列为QMTKSYKNTRKS)，用包被 缓冲液将多肽溶解并稀释至l〇yg/mL;96孔酶标板每孔加入100yL多肽溶液，4°C反应12h 后，用缓冲液洗板3次;每孔加入200yL封闭液，37 °C孵育lh后洗板3次，冷冻干燥后，封口膜 封好，4°C保存。
[0036] 2、试剂的配制：
[0037] (1)包被缓冲液(？!19.6):为含有1.598/1他2〇)3和2.938/1他!10) 3的水溶液。
[0038] (2)PBS缓冲液（pH 7.4):8.0g NaCl、0.2g KH2P〇4、2.9g Na2HP〇4.12H2〇和0.2g KC1，溶解在lOOOmL蒸馏水。
[0039] (3)封闭液、样本稀释液和酶稀释液：lg牛血清白蛋白溶解在lOOmL PBS缓冲液中。
[0040] (4)工作浓度的酶标抗体：lyL市售辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG抗体溶解在 5000yL酶稀释液中。
[0041 ] (5)25倍浓缩洗涤液:6g/L KH2P04、5g/L KCl、36g/L Na2HP〇4、200g/L NaCl和体积 分数1.25%的Tween 20的水溶液，临用前用纯净水稀释25倍，得到洗涤缓冲液，现配现用。 [0042] (6)阳性对照血清：获取感染H7N9禽流感病毒的患者的血液，分离获得血清，稀释 100 倍。
[0043] (7)阴性对照血清：获取未感染H7N9禽流感病毒的正常人的血液，分离获得血清， 稀释100倍。
[0044] (8)TMB显色液和终止液采用市售试剂。
[0045] 实施例5
[0046] 样品收集后，分离血清，如果不是马上进行检测，则可以置于-20°C保存，检测前于 室温下解冻。
[0047] (1)从冰箱取出各试剂，恢复至室温。
[0048] (2)用样本稀释液将待检血清做1:100稀释。
[0049] (3)设置2个阳性对照孔，各加 100yL阳性对照血清。
[0050] (4)设置2个阴性对照孔，各加 100yL阴性对照血清。
[0051] (5)设置2个空白对照孔，各加 1 OOyL样本稀释液。
[0052] (6)每个待检测样设置2个重复孔，每孔加 100yL稀释好的血清样品。
[0053] (7)封口膜封好后，将酶标板置于37 °C孵育1 h。
[0054] (8)洗板:浓缩洗涤液稀释后，每孔加入300yL洗涤液，反复洗涤3~5次，最后一次 在吸水纸上拍干。
[0055] (9)向包被酶标板中加入100yL工作浓度的酶标抗体，37 °C孵育30~60min。
[0056] (10)洗板:同步骤(8)。
[0057] (11)显色:每孔加入100yL TMB显色液，37°C反应15min。
[0058] (12)每孔加入50yL终止液终止反应。
[0059] (13)将酶标板置于酶标仪上，读取450nm波长下的0D值。
[0000] (14)待测样本的阳性判断标准:Cutoff = 2.1 X阴性对照孔平均值0D45Q，当待测样 本0D45Q 2 Cutof f值为阳性;样品0D45Q < Cutof f值为阴性。
[0061 ] 实施例6
[0062] 获取3例感染H7N9禽流感病毒的患者血清和1例正常人血清，患者血清1、2、3获取 时间分别为2013年10月15日、2013年11月1日和2013年12月8日。使用本发明的检测试剂盒， 按实施例5中记载方法进行检测，所有结果均以均值±标准差表示，所得结果如图4所示，正 常人的阴性血清0D45Q<Cut〇f f值，而三组患者的血清检测值0D45Q>Cut〇f f值。
【主权项】
1. 一种抗原多肽，为如下(a)或(b)的蛋白质： (a) 氨基酸序列为QMTKSYKNTRKS的蛋白质； (b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸能够与人抗H7亚型 禽流感病毒血凝素抗体特异性结合的蛋白质。2. 如权利要求1所述的抗原多肽在制备诊断人感染H7亚型禽流感病毒的试剂盒或试纸 条中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为多肽酶联免疫吸附试剂盒。4. 一种诊断人感染H7亚型禽流感病毒的多肽酶联免疫吸附试剂盒，包括预包酶标板， 其特征在于，所述预包酶标板包被如权利要求1所述的抗原多肽。5. 如权利要求4所述的多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，所述抗原多肽每孔包被 量为lyg。6. 如权利要求4所述的多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，包括样品稀释液、阴性 对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、TMB显色液和终止液。7. 如权利要求4-6任一所述的多肽酶联免疫吸附试剂盒的使用方法，包括结果分析，其 特征在于，所述结果分析的方法为：Cutoff = 2.1 X阴性对照孔平均值0D45Q，当待测样本 0D45Q 2 Cutoff值为阳性；当待测样本0D45Q<Cut〇ff值为阴性。
【专利摘要】本发明公开了一种抗原多肽，氨基酸序列为QMTKSYKNTRKS或在此基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸能够与人抗H7亚型禽流感病毒血凝素抗体特异性结合的多肽；本发明还公开了所述抗原多肽在制备诊断人感染H7亚型禽流感病毒的试剂盒或试纸条中的应用；本发明还公开了一种试剂盒，包括预包酶标板，预包酶标板包被所述的抗原多肽。本发明公开试剂盒检测灵敏度高、特异性强、成本低、方法简便、快速、重复性好，适用于人感染H7亚型禽流感病毒的快速检测和流行病学研究，特别是能够适合于基层单位使用。
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/68, C07K14/11
【公开号】CN105646678
【申请号】
【发明人】陶薇, 洪艳, 罗永能, 高孟, 姜立民, 谢珲, 倪红霞, 高丽美, 傅婷, 何卓晶
【申请人】浙江省医学科学院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月6日