mH I双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送擎科生物进 一步测序验证正确。从而完成HPV-58E7基因原核表达载体的构建(见图1)。
[0032] 实施例2:HPV 58型E7基因真核表达载体的构建
[0033] 用PCR方法从pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒中扩增出HPV-58基因，所用的引物冊乂-58E7_E up(SEQ ID N0.3)、HPV-58E7_E dn(SEQ ID N0.4)由擎科生物合成。用于真核表达 的上下游引物分别引入EcoR I和BamH I酶切位点。
[0034] HPV-58E7_E up：5；-CCGGAATTCATGAGAGGAAACAACCCAACGC-3'
[0035] HPV-58E7_E dn：；-CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3'
[0036] PCR反应条件：50yL反应体系中，加入lyL pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒，20ymol/L的 上下游引物各luL，2·5mmol/L的dNTP mixture 4yL，5XBuffer(Mg2+plus) 10yL，rTaq聚合酶 〇.5yL，剩余用ddH20补足。用ABI公司的（型号为2720)PCR仪，PCR反应条件为94°C预变性 51^11 ;94°(：变性3〇8;60°(：退火3〇8;72°(：延伸3〇8，共40个循环以后，再72°(：延伸71^11。通过 1.5%凝胶电泳分析得到预期为317bp的用于真核表达的HPV-58E7序列。将上述扩增的产物 电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
[0037] 真核表达质粒pEGFP-Cl及HPV-58E7序列用EcoR I和BamH I双酶切。以适当比例将 上述线性pEGFP-Cl和HPV-58E7基因片段混合，用T4DNA连接酶在16°C水浴中连接过夜。转化 入DH5a后，铺于含50yg/mL kana的LB琼脂平皿，37 °C培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种 5mL含50yg/mL kana的LB液体培养基中，37°C培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pEGFP-Cl-(HPV-58E7)质粒，并用EcoR I和BamH I双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送擎科生物进一步 测序验证正确。从而完成HPV-58E7基因真核表达载体的构建(见图2)。
[0038] 实施例3:HPV 58型E7蛋白的诱导表达
[0039] pGEX-4T2-(HPV-58E7)质粒分别转化至大肠杆菌DH5a，接种于含氨苄青霉素(Amp) 100yg/mL的LB培养液，待细菌0D值介于0.6-0.8之间，加 IPTG至终浓度为0.2mM，诱导温度： 26-28°C，诱导4-6h后收集细菌，冰浴超声裂解菌体，4°C12000rpm lOmin离心分离上清和沉 淀，并经15%聚丙烯凝胶电泳鉴定(见图3)。
[0040] 实施例4:HPV 58型E7蛋白的纯化和酶切
[0041 ] 取菌体上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获 取HPV-58E7蛋白，PBS透析蛋白过夜，并经聚丙烯凝胶电泳鉴定(见图4)。
[0042] 实施例5:HPV 58E7蛋白兔多克隆抗体的制备和纯化
[0043]用纯化后的HPV-58E7蛋白免疫新西兰雌兔，体重为2.5kg为宜。初次免疫用含E7蛋 白500yg的抗原完全弗氏佐剂乳化剂1.6mL于兔子背部多点皮内注射，以后每隔10d用含E7 蛋白500yg的抗原不完全弗氏佐剂乳化剂加强免疫3次。耳缘静脉采血，双向免疫扩散法测 定血清中多价抗血清效价（1:8以上符合要求）。10d后，E7蛋白500yg直接腹股沟区肌肉注 射。5d后麻醉下心脏取血，分离血清后分装并置-20°C保存。血清按rProtein G Agaros说明 书操作，亲和层析获得抗体IgG。
[0044] 实施例6:HPV 58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(Western blot)
[0045] 转染24h前将293T细胞以5\106个/!1^浓度接种于10〇11的培养皿(含10%?83和双 抗的DMEM培养基、5%C02、37°C)。转染前，培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine 2000说明书操作，将质粒pEGFP-Cl、重组质粒pEGFP-Cl-(HPV-58E7)各取10yg分别与20μ1转 染试剂Lipofectamine 2000在DMEM培养基中形成复合物，混合室温放置30min后覆盖于 10cm的培养皿，293T未转染细胞做转染空白对照。转染6h后，将培养基换成含10%FBS的 DMEM，培养24h后，荧光显微镜下观察转染效率，终止转染。用RIPA细胞裂解液提取蛋白，用 BCA试剂盒（碧云天）测蛋白浓度，以每孔40yg的总蛋白经95°C变性后5miη后，以10 % SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，以兔抗HPV 58型Ε7多克隆抗IgG为一抗，稀释比 1:5000,1:5000羊抗兔IgG-HRP为二抗进行免疫印迹，ECL显色(见图5)。
[0046]实施例7:HPV 58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(免疫荧光）
[0047]转染24h前将293T细胞以2.5 X105个/mL浓度接种于放有细胞爬片的6孔板（含 10%FBS和双抗的DMEM培养基、5%⑶2、37°C)。转染前，培养基换成无血清的DMEM。转染按 Lipofectamine 2000说明书操作，将质粒pEGFP-Cl、重组质粒pEGFP-Cl-(HPV-58E7)各取4μ g分别与8μ1转染试剂Lipofectamine 2000在DMEM培养基中形成复合物，混合室温放置 30min后覆盖于6孔板中，293T未转染细胞做转染空白对照。培养24h后，荧光显微镜下观察 转染效率，终止转染。将6孔板中的细胞爬片用PBS洗3遍后依次4%多聚甲醛室温固定 1011^11、0.1%1^切1^-100室温孵育71^11，期间？83洗3遍，每次51^11。置于4°(：保存或进行免 疫荧光分析。免疫荧光实验在暗盒中进行。取出上述爬有293T细胞(转染pEGFP-Cl质粒的细 胞作对照）盖玻片于10 %山羊血清室温封闭2h，1:500(5 %山羊血清稀释）的HPV-58E7兔多 克隆抗体IgG为一抗4°C孵育过夜，1:500(5%山羊血清稀释）的Alexa Flour555羊抗兔IgG 为二抗室温孵育lh，0.5μg/ml DAPI染色8min，期间用PBS洗3遍每次5min。封片后荧光显微 镜观察(见图6)
[0048]实施例9:HPV 58型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(免疫组化）
[0049] 收集临床宫颈癌标本，通过RT-PCR鉴定HPV感染的类型。取HPV 58型阳性的组织， 通过包埋，切片，烤片，脱蜡，抗原修复(柠檬酸缓冲液），血清封闭。一抗(1:500)，4°C孵育过 夜。PBS洗三次后，滴加二抗（1:1000)，室37°(：静置111，？83再洗三次后，048显色5-101^11。自 来水冲洗lOmin，苏木精复染，盐酸酒精分化，自来水再冲洗lOmin。脱水后封片镜检(见图 7)。
【主权项】
1. 人乳头瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法，通过以下步骤实现： (1 )HPV-58E7基因的调取及扩增：设计HPV-58E7的扩增引物，并从HPV-58阳性人宫颈上 皮细胞中有效扩增出这个基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV-58E7序列的上游引物序 列为SEQ ID NO· 1:5'-CCGGGATCCATGAGAGGAAACAACCCAACG-3'，划线部分为BamH I酶切位 点，下游引物序列为SEQ ID NO.2:5'-CCGGAATTCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3'，划线部分为 EcoR I酶切位点； 用于扩增用于真核表达的HPV-58E7序列的上游引物序列为SEQ ID NOJd'-CCG^O^ATGAGAGGAAACAACCCAACGC-S '，划线部分为EcoR I酶切位点，下游引物序列为SEQ ID NO. 4:5 ' -CCGGGATCCTTATTGCTGTGCACAGCTAGG-3 '，划线部分为BamH I酶切位点； (2) HPV-58E7基因原核及真核表达载体的构建:将步骤（1)中得到的这两个含不同酶切 位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，获得用于后续 实验的重组载体PGEX-4T2-(HPV-58E7)和pEGFP-Cl-(HPV-58E7); (3) GST-(HPV-58E7)融合蛋白的原核表达：将步骤（2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-58E7)转入大肠埃希菌DH5a，待细菌0D值介于0.6-0.8之间，加 IPTG至终浓度为0.2mM， 并在26-28°C的诱导温度下，诱导4-6h后收集细菌，在250-300W超声功率下，超声时间9秒， 间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清； (4) GST-(HPV-58E7)融合蛋白的纯化及HPV-58E7蛋白的获得:通过(3)步骤获得的上清 与Glutathione-Sepharose 4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-58E7蛋白，PBS 透析过夜获得纯化的HPV-58E7蛋白。2. 根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒58E7蛋白表达纯化方法，其特征在于，步骤（1)、 (2)、（ 3)中，大肠埃希菌宿主DH5a、真核表达载体PEGFP-C1购于大连宝生物TaKaRa，原核表 达载体PGEX-4T2从GE health care公司购得。3. 根据权利要求1所述方法获得的人乳头瘤病毒58E7蛋白在制备多克隆抗体中的应 用。
【专利摘要】本发明提供一种人类乳头瘤病毒HPV-58E7蛋白的表达纯化方法，通过设计HPV-58E7的扩增引物，从HPV-58阳性细胞中有效扩增出该基因，将含不同酶切位点的HPV-58E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得重组载体，再与Glutathione-Sepharose？4B磁珠结合，切除GST标签，获取HPV-58E7蛋白，经PBS透析过夜纯化。本发明获得的人类乳头瘤病毒HPV-58E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体，可在制备多克隆抗体中应用。
【IPC分类】C07K14/025, C07K16/08, C12N15/70, C12N15/79, C12N15/37
【公开号】CN105646677
【申请号】
【发明人】程浩, 郑俏丽, 姜少杰, 陈贤祯, 朱江, 金纳
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月28日