血管紧张素i氨基酸片段的衍生物、血管紧张素i抗原及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学技术领域，涉及血管紧张素 I氨基酸片段的衍生物、血管紧张素 I抗原及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 血管紧张素(Angiotensin)是一种能够使收缩血管，并由此造成压升高血的多肽。 血管紧张素是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的一部分，许多降血压药物以血管紧张素为靶 分子。血管紧张素也能够刺激肾上腺分泌。
[0003] 血管紧张素 I(Angiotensin I，AI)是由肾素作用于血管紧张素原转变而来，因此 可反映"血浆肾素活性"（简称PRA)。原发性高血压、特发性或假性醛固酮增多症、肾上腺癌、 肾上腺皮质增多症激素合成缺陷等疾病会导致血管紧张素 I降低;而继发性醛固酮增多症、 肾功能减退、肾炎、充血性心力衰竭、肾血管瘤、分泌肾素的肾球旁器增生症、嗜铬细胞瘤、 肝硬化等疾病会导致血管紧张素 I升高。因此，AI浓度的测定已成为原发性和继发性高血压 等疾病诊断与研究的重要指标。
[0004] AI的测定中，抗体是决定分析灵敏度和特异性的主要因素之一。由于AI分子量较 小，因此必须偶联在大分子上以后才能用于免疫原刺激产生抗体。申请号为 200910250475.5的中国专利公开了一种血管紧张素 I免疫原的制备方法，采用戊二醛为交 联剂将AI连接在蛋白载体上，但是该方法会造成抗原和载体的无序交联，容易改变AI的天 然抗原决定簇，以及引起载体自身交联沉淀，因此并不是一种优选的免疫原制备方法。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种具有特定序列 的AI氨基酸片段的衍生物，将这些AI氨基酸片段的衍生物与活化载体反应可以制得完全的 AI抗原，以该抗原接种健康动物可以成功获得AI抗体，由此可实现AI的高效检测。
[0006] 为此，本发明第一方面提供了一种血管紧张素 I(AI)氨基酸片段的衍生物，其序列 选自：
[0007] a)Cys-R-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0008] b)Cys-R-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0009] c)Cys-R-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0010] d)Cys-R-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0011] e)Cys-R-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0012] f)Cys-R-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0013] g)Cys-R-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0014] h)Cys-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0015] i)Cys-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0016] j)Cys-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0017] k)Cys-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0018] 1)Cys-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0019] m)Cys-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0020] n)Cys-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0021] 其中R选自氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸。
[0022]本发明第二方面提供一种血管紧张素 I抗原，其含有如本发明第一方面所述的血 管紧张素 I氨基酸片段的衍生物的序列之一。
[0023] 根据本发明，所述抗原由如本发明第一方面所述的血管紧张素 I氨基酸片段的衍 生物与活化载体反应制得。
[0024] 在本发明的一些优选的实施例中，所述载体选自血蓝蛋白、牛血清白蛋白、阳离子 牛血清白蛋白、牛γ -球蛋白、甲状腺球蛋白、卵白蛋白、破伤风类毒素、多聚赖氨酸和葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶。
[0025]本发明第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的血管紧张素 I抗原的制备方 法，其包括：
[0026]步骤S1，将含有交联剂和载体的混合液进行反应制得活化载体悬液；
[0027]步骤S2,将活化载体悬液进行分离纯化处理制得纯化的活化载体溶液；
[0028]步骤S3,将纯化的活化载体溶液与血管紧张素 I氨基酸片段的衍生物溶液混合后 反应制得血管紧张素 I抗原悬液；
[0029]步骤S4,将血管紧张素 I抗原悬液进行分离纯化处理制得纯化的血管紧张素 I抗原 溶液。
[0030] 在本发明的一些实施例中，在步骤S1中，在含有交联剂和载体的混合液中，交联剂 与载体的摩尔比为（10-2000) :1。
[0031] 在本发明的另一些实施例中，在步骤S3中，所述载体与血管紧张素 I氨基酸片段的 衍生物的摩尔比为（10-2000) :1。
[0032] 根据本发明方法，所述血管紧张素 I氨基酸片段的衍生物溶液是由血管紧张素 I氨 基酸片段的衍生物溶于C溶剂制得，并且所述血管紧张素 I氨基酸片段的衍生物溶液的浓度 为0. l-50mg/ml。优选所述血管紧张素 I氨基酸片段的衍生物溶液的浓度为0 . l-4mg/ml。所 述C溶剂选自纯化水、PBS缓冲液、二甲亚砜、二甲基甲酰胺或其组合。
[0033] 本发明中，所述交联剂包括磺基琥珀酰亚胺基-4_(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1- 羧酸酯（sulf〇-SMCC)、m-苯甲酰马来酰亚胺-N-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulf〇-MBS)、E-马来 酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯（sulfo-EMCS)和N-(4-马来酰亚胺氧化丁酰)-琥珀酰亚胺磺 酸钠盐(sulfo-GMBS)中的一种或几种。
[0034] 在本发明的一些实施例中，在步骤S1中，所述含有交联剂和载体的混合液由交联 剂溶于载体溶液形成。
[0035] 在本发明的另一些实施例中，在步骤S1中，所述含有交联剂和载体的混合液由交 联剂溶液与载体溶液混合形成。
[0036] 根据本发明方法，所述交联剂溶液由交联剂溶于B溶剂形成，并且所述交联剂溶液 的浓度为1 -1 〇〇mg/ml;优选所述交联剂溶液的浓度为1 -1 Omg/ml;所述B溶剂选自纯化水、 PBS缓冲液和二甲亚砜。
[0037] 根据本发明方法，所述载体溶液由载体溶于A溶剂形成，并且所述载体溶液的浓度 为l-100mg/ml;优选所述载体溶液的浓度为l-10mg/ml;所述A溶剂为纯化水或PBS缓冲液。
[0038] 本发明第四方面提供了一种如本发明第二方面所述的抗原或者如本发明第三方 面所述的方法制备的抗原在制备抗血管紧张素 I抗体中的应用。
[0039]本发明第五方面提供了一种抗血管紧张素 I抗体，其由如本发明第二方面所述的 抗原或者如本发明第三方面所述的方法制备的抗原对健康动物进行免疫接种后产生。
[0040]本发明第六方面提供了一种如本发明第五方面所述抗体的制备方法，其包括：
[0041 ]步骤L，采用抗血管紧张素 I抗原对健康动物进行免疫接种；
[0042]步骤Μ，采取免疫血清并测定免疫血清的抗体效价，并在抗体效价低于预定值时重 复步骤L-M;
[0043]步骤Ν，当抗体效价2预定值时收集抗体血清，并进行分离纯化处理，制得抗血管 紧张素 I抗体；
[0044] 其中，所述预定值为1:5000。
[0045]本发明第七方面提供了一种如本发明第五方面所述的抗血管紧张素 I抗体或如本 发明第六方面所述的方法制备的抗血管紧张素 I抗体在制备用于血管紧张素 I免疫分析的 试剂中的应用。
[0046] 本发明第八方面提供了一种如本发明第五方面所述的抗血管紧张素 I抗体或如本 发明第六方面所述的方法制备的抗血管紧张素 I抗体在制备用于血管紧张素 I化学发光免 疫测定的试剂盒中的应用。
【具体实施方式】
[0047] 为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅 起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
[0048] 如前所述，由于血管紧张素是小分子多肽，激发不了动物机体产生抗体，也无法直 接应用于免疫检测。为了实现ΑΙ的高效检测，本发明的发明人对ΑΙ抗原及其抗体的制备和 检测进行了大量研究，发现了一些具有特定序列的ΑΙ氨基酸片段的衍生物，并且进一步研 究发现，将这些ΑΙ氨基酸片段的衍生物与活化载体反应可以制得完全的ΑΙ抗原，以该抗原 接种健康动物可以成功获得ΑΙ抗体，由此可以实现ΑΙ的高灵敏检测。本发明正是基于上述 发现作出的。
[0049] 因此，本发明第一方面所提供的ΑΙ氨基酸片段的衍生物，由本发明的发明人研究 发现，并用固相多肽合成仪制得，其序列选自：
[0050] a)Cys-R-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0051 ] b)Cys-R-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0052] c)Cys-R-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0053] d)Cy s-R_Tyr_11e -Hi s _Pr〇-Phe -Hi s -Leu;
[0054] e)Cys-R-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0055] f)Cys-R-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0056] g)Cys-R-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0057] h)Cys-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0058] i)Cys-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0059] j)Cys-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0060] k)Cys-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0061 ] 1)Cys-Ile-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0062] m)Cys-His-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0063] n)Cys-Pr〇-Phe-His-Leu；
[0064] 其中序列a)_g)中的R选自氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸。 [0065] 尤其优选的是，AI氨基酸片段的衍生物的 Pro-Phe-His-Leu; c)Cys-R-Val-Tyr-Ile-His-Pr〇-Phe-His_Leu;或者d)Cys-R-Tyr_Ile-His-Pro-Phe-His-Leu 其中1?优选氨基丁酸。
[0066] 本发明第二方面所提供的AI抗原由本发明第一方面所述的AI氨基酸片段的衍生 物与活化载体反应制得，因此，也可以理解为本发明的AI抗原含有本发明第一方面所述的 AI氨基酸片段的衍生物。
[0067] 本发明对所用载体没有特别的限制，例如可以采用常规的载体。在本发明的一些 实施例中，所述载体，例如可以选自血蓝蛋白（KLH)、牛血清白蛋白（BSA)、阳离子牛血清白 蛋白（