为81%，灯盏花甲素的相对含量为11%。高效液相检测图如图2所示。
[0038]步骤3:灯盏细辛酸化沉淀上聚乙烯大孔树脂后，所得到灯盏花甲素馏分中灯盏花 乙素相对含量为8%，灯盏花甲素相对含量为81%。高效液相检测图如图3。
[0039]步骤4:将上了大孔树脂后的灯盏花甲素部分用制备型高效液相色谱纯化，得到 98.3%含量的灯盏花甲素，用高效液相分析检测图谱如图4。
[0040] 步骤1-4的每一步骤用高效液相色谱柱检测：色谱柱Zobax SB_C18(4.6mm X 250mm，5μ)，流动相:0分钟时，10%流动性A，90%流动相B; 20分钟时，90%流动性A，10%流 动相B; 20.1分钟时，10 %流动性A，90 %流动相B; 26分钟时，10 %流动性A，90 %流动相B。 [0041 ]其中，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5 %的甲酸水溶液.检测条件为:流速1. OmL/ min，检测波长335nm，柱温30 °C 〇
【附图说明】
[0042]图1:灯盏细辛浸膏的HPLC图；
[0043]图2:灯盏细辛浸膏碱溶酸化后沉淀HPLC图谱；
[0044]图3:灯盏细辛酸化沉淀上大孔树脂后HPLC图谱；
[0045]图4:高效制备液相纯化后的灯盏花甲素 HPLC图谱。
[0046]其中，1为灯盏乙素，2为灯盏甲素。 具体实施方案
[0047]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
[0048] 实施例1:
[0049] 1)试验步骤：
[0050] (1)取灯盏细辛药材l〇〇〇g用65 %的乙醇回流提取，每次提取1小时，提取三次，减 压浓缩，得到灯盏细辛浸膏。
[0051] (2)将灯盏细辛浸膏加3倍量水稀释，用5 %氢氧化钠溶液将其pH调至9,使其溶解。 过滤，滤液加10%稀硫酸溶液将其pH调至2静置过夜，使其沉淀，过滤，得到含有灯盏花乙素 和甲素的酸化沉淀物。
[0052] (3)取灯盏细辛沉淀物，加入10 %碳酸氢钠溶液溶解使pH调至7.0,上处理好的 D101柱(上样量-树脂重量1:20)，用纯化水冲洗。弃去前面2.5升水流出馏分，收集2.6-12升 馏分。减压浓缩至稀膏(密度为1.10)。
[0053] (4)将含有灯盏花甲素的稀膏上制备液相柱，采用C18反相硅胶色谱柱，色谱柱尺 寸为Φ 30 X 300mm，C18反相硅胶填料，粒径为ΙΟμπι，以水(含0.5 %甲酸)-甲醇62: 38为流动 相，检测波长:335nm流速:40ml/min，出峰时间：20min。收集20-30分钟馏分。得到灯盏花甲 素单体。
[0054] 2)试验结果:经HPLC分析，纯度2 98.0 %。
[0055] 实施例2:
[0056] 1)试验步骤：
[0057] (1)取灯盏细辛药材1000g用水回流提取，每次提取1小时，提取三次，减压浓缩，得 到灯盏细辛浸膏。
[0058] (2)将灯盏细辛浸膏加2倍量水稀释，用5%碳酸钠溶液将其pH调至10,使其溶解。 过滤，滤液加10%稀盐酸溶液将其pH调至1静置过夜，使其沉淀，过滤，得到含有灯盏花乙素 和甲素的酸化沉淀物。
[0059] (3)取灯盏细辛沉淀物，加入10 %碳酸钠溶液溶解使pH调至7.5，上处理好的D102 柱(上样量-树脂重量1:15)，用纯化水冲洗。弃去前面3升水流出馏分，收集3-15升馏分。减 压浓缩至稀膏(密度为1.08)。
[0060] (4)将含有灯盏花甲素的稀膏上制备液相柱，采用C18反相硅胶色谱柱，色谱柱尺 寸为〇30\300臟，(：18反相硅胶填料，粒径为1(^111，以水(0.1%甲酸)-乙腈82:18为流动相， 检测波长:280nm流速:30ml/min，出峰时间：26min。收集26-38分钟馏分。得到灯盏花甲素单 体。
[0061 ] 2)试验结果:经HPLC分析，纯度2 98 · 3 %。
[0062] 实施例3:
[0063] 1)试验步骤：
[0064] (1)取灯盏细辛药材1000g用90%乙醇回流提取，每次提取1小时，提取三次，减压 浓缩，得到灯盏细辛浸膏。
[0065] (2)将灯盏细辛浸膏加4倍量水稀释，用5 %氢氧化钠溶液将其pH调至10,使其溶 解。过滤，滤液加10%稀硫酸溶液将其pH调至1静置4小时，使其沉淀，过滤，得到含有灯盏花 乙素和甲素的酸化沉淀物。
[0066] (3)取灯盏细辛沉淀物，加入5 %氢氧化钾溶液溶解使pH调至8，上处理好的AB-8柱 (上样量-树脂重量1: 25)，用纯化水冲洗。弃去前面2.4升水流出馏分，收集2.5-15升馏分。 减压浓缩至稀膏(密度为1.06)。
[0067] (4)将含有灯盏花甲素的稀膏上制备液相柱，采用C18反相硅胶色谱柱，色谱柱尺 寸为中30\300臟，(：18反相硅胶填料，粒径为1(^111，以水（1%甲酸)-甲醇50:50为流动相，检 测波长：335nm流速:50ml/min，出峰时间：18min。收集18-28分钟馏分。得到灯盏花甲素单 体。
[0068] 2)试验结果:经HPLC分析，纯度2 98.5 %。
【主权项】
1. 一种灯盏花甲素的制备方法，包括如下步骤： (1) 灯盏细辛加入乙醇或水回流提取2-3次，合并提取液，减压浓缩成浸膏； (2) 将灯盏细辛浸膏用浓度为0.1-20%的稀碱溶液溶解至pH 7-10之间，使浸膏溶解 后，过滤;滤液加酸调pH值至1-3，静置后过滤;得到沉淀； (3) 将沉淀用碱溶解，调节pH值6-9之间，上苯乙烯型大孔树脂层析柱，用水冲洗，分别 接收洗脱液，以液相检测，收集灯盏花甲素相对含量大于60%及以上的馏分。将含有灯盏花 甲素的洗脱液部分减压浓缩成清膏； (4) 将含有灯盏花甲素的清膏上制备液相柱，以有机溶剂和含有酸的水作为流动相，进 行纯化分离，收集灯盏花甲素纯品。检测波长为270-335nm，收集保留时间在lOmin以后的馏 分，该馏分为灯盏花甲素纯品。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（1)中的乙醇含量为0-95%;优选50%-80 %的乙醇溶液;更优选65 %的乙醇溶液;该百分比为体积百分比。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中的碱溶液为碳酸钠，碳酸氢钠，氢 氧化钠，碳酸钾，碳酸氢钾，氢氧化钾中的一种或几种。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中加入的酸为盐酸，硫酸或者磷酸。5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中的碱溶液为碳酸钠，碳酸氢钠，氢 氧化钠，碳酸钾，碳酸氢钾，氢氧化钾中的一种或几种。6. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中苯乙烯型大孔树脂为D101，DA201， D301，D401，D141，D160，AB-8HPD100，HPD450或HPD600;洗脱液洗脱顺序为色素、灯盏花乙 素、灯盏花甲素。7. 根据权利要求1所述的灯盏花甲素的提取方法，其特征在于:所述步骤(4)中制备液 相柱为C18反相硅胶填充柱。8. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)中洗脱液中有机溶剂为甲醇，乙醇或 者乙腈中的一种，含酸的水相为0.01-1%的甲酸或者乙酸水溶液;有机溶剂与酸水的比例 为 10-70% 〇9. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（4)中梯度洗脱条件为：以62: 38的含 0.5%甲酸的水-甲醇为流动相，检测波长270-280nm，流速40ml/min，收集20-40分钟馏分； 或者以82:18的含0.1%甲酸的水-乙腈为流动相，检测波长320-33511111，流速301111/1^11，收集 25-45分钟馏分;或者以50:50的含1 %乙酸的水-甲醇为流动相，检测波长335nm，流速50ml/ min，出峰时间18min;收集15-45分钟馏分。
【专利摘要】本发明提供了一种灯盏细辛制备灯盏花甲素的方法，采用醇或者水回流提取，大孔吸附柱层析富集，制备高效液相色谱纯化的工艺流程。具有成本低，易操作，高含量的特点；本发明的方法适用于工业级生物医药用液相制备色谱装置，以实现高纯度灯盏花甲素的工业化生产。
【IPC分类】C07H1/08, C07H17/07
【公开号】CN105646620
【申请号】
【发明人】林艳和, 伏继平, 苏海霞
【申请人】云南生物谷药业股份有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2015年12月29日