一种头孢噻呋半抗原及其胶体金检测装置及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种头孢噻呋半抗原及其胶体金检测装 置及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 头孢噻呋是一种亲脂弱碱性乙胺嘧啶类抑菌剂，其抗菌谱和磺胺类药物相似，但 抗菌作用较磺胺类药物强，对大肠杆菌、奇异变形杆菌、肺炎杆菌、腐生葡萄球菌、多种革兰 阳性和阴性细菌有效，但对绿脓杆菌感染无效，最低抑菌浓度常低于lOmg/1，单用易引起细 菌耐药性，故一般不单独使用，主要与磺胺药组成复方制剂。因此它又被称为磺胺增效剂， 用于扩大抗菌谱，增强抗菌活性。临床上用于治疗尿路感染、肠道感染、呼吸道感染、菌痢、 肠炎、伤寒、脑膜炎、中耳炎、流脑、败血症及软组织感染等。可与长效磺胺药合用于耐药恶 性疟的防治。随着磺胺类药物在兽医临床上不合理的使用，甚至滥用，以至于抗菌增效剂类 药物在动物源性食品中的残留会不可避免地发生。人类长期食用含有头孢噻呋残留的动物 性食品及其制品，将有可能对人类健康产生危害。因此为了加强对动物性食品中这类药物 的监控，建立一种准确、快速、方便的头孢噻呋残留量检测方法很有必要。
[0003] 目前，国内外检测头孢噻呋的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，液相-质谱联用 (LC-MASS)法和酶联免疫吸附(ELISA)法。在食品安全检测中，往往先用ELISA初筛后再对阳 性样本用HPLC或LC-MASS进行确证。上述方法中所用仪器设备安规复杂、成本高、对操作人 员技术要求高且不能立即显示结果，因此不适用于商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象进行 快速的在线检测和监控。
【发明内容】
[0004] 针对以上技术问题，本发明公开了一种头孢噻呋半抗原及其胶体金检测装置及其 制备方法，针对现有检测头孢噻呋技术的不足，建立一种检测头孢噻呋残留的快速方法，使 其能更加快速、灵敏、简便地检测头孢噻呋残留，满足了快速检测的需要。
[0005] 对此，本发明采用的技术方案为： 一种头孢噻呋半抗原，其具有式(1)所示的化学结构式：
[0006] 上述分子式的化学名为(6R，7R)-7-[2-(2-氨基丙酸噻唑-4-基)-(Z)-2-(甲基亚 胺基）乙酰胺基]-3- [ (2-呋喃基羰基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸，其分子式为C22H21N5〇 9S3， MASS[M+H]峰值为596.4，熔点为249度。
[0007] 作为本发明的进一步改进，所述的头孢噻呋半抗原采用以下步骤制备得到： 步骤S1:将头孢噻呋钠溶解于甲醇中，加入冰乙酸，于20~30°C下搅拌10~120分钟，其 中，所述冰乙酸的摩尔量是头孢噻呋钠摩尔量的1~3倍;再加入水，二氯甲烷萃取，旋干有机 相，得到淡粉红色固体； 步骤S2:取步骤S1中得到的淡粉红色固体溶于DMF(二甲基甲酰胺）中，加入碳酸钾及溴 丙酸，35~45 °C下反应2~8小时，采用二氯甲烷萃取过柱提纯得所述头孢噻呋半抗原。
[0008] 本发明还公开了一种头孢噻呋免疫抗原，采用如上所述的头孢噻呋半抗原制备得 至1J，将所述头孢噻咲半抗原与DCC(Dicyclohexylcarbodiimide，二环己基碳二亚胺）、NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)混合，于4°C下搅拌，离心后取上清液;将人血清蛋白溶于pH值为8.0 的PBS溶液中，加入DMF后搅拌，然后将所述上清液逐渐加入其中，4°C下反应12h，离心后， 取上清液，透析纯化，得到所述头孢噻呋免疫抗原。
[0009] 作为本发明的进一步改进，所述透析纯化时，在4°C下用生理盐水透析3天，每天更 换3次透析液。
[0010] 本发明还公开了一种头孢噻呋单克隆抗体，采用如上所述的头孢噻呋免疫抗原与 免疫Balb/c小鼠经细胞融合，筛选得到分泌头孢噻呋单克隆抗体的杂交瘤细胞，用获得的 杂交瘤细胞采用体内诱生腹水法制备得到头孢噻呋单克隆抗体。
[0011]优选的，所述头孢噻呋单克隆抗体采用以下方法制备得到:使用所述头孢噻呋免 疫抗原并鉴定后免疫4只6周龄昆明小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上 升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备 脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清 IPMI1640培养基，1100r/min离心5分钟弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37摄氏度水浴中。 把lmL50%(体积百分比）PEG-4000缓缓加入细胞中，在1分钟内滴完，同时轻轻搅动底部沉 淀，静置1分钟后，前30秒沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基lmL，后30秒加入2mL，然后快 速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5分钟，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到 已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37摄氏度、体积百分比5%的C0 2条件下培养。7天后 换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定)法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺 盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌 单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备;然后，采用体内 诱生腹水法生产头孢噻呋单克隆抗体。
[0012] 作为本发明的进一步改进，所述体内诱生腹水法的步骤为:对小鼠腹腔注射液体 石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射所述杂交瘤细胞3~5X10 6/只，10天后，待小鼠腹部明显 膨大时收集腹水，用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水得到所述头孢噻呋单克隆抗体。
[0013] 本发明还公开了一种头孢噻呋胶体金检测装置，其包括反应杯和检测试纸，所述 检测试纸包括底板，以及底板上依次铺设的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸;所述反应杯里 含有胶体金标记的如上所述头孢噻呋单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和控制 线，所述检测线为采用如上所述的头孢噻呋免疫抗原在硝酸纤维素膜上进行喷涂制得。
[0014] 作为本发明的进一步改进，所述控制线为采用兔抗鼠 IgG进行喷涂制得，所述检测 线和控制线相互平行。优选的，所述检测线和控制线距离至少〇.5cm。
[0015] 优选的，所述兔抗鼠 IgG是通过以下方法获得： 用载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50yg~100yg/次，背部皮下分多点 注射，其中所述载体蛋白为常规的载体蛋白，优选人血清白蛋白、卵清蛋白或牛血清白蛋 白；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化;加强免疫，用合成的人工抗原与等 量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4~5次，每次间隔4~8周，最后一次免疫后10~15天，以 ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取 兔抗鼠 I gG抗体，-20 °C冻存备用。
[0016] 本发明还公开了如上所述的头孢噻呋胶体金检测装置的制备方法，其包括以下步 骤： 步骤A:将头孢噻呋钠溶解于甲醇中，加入冰乙酸，于20~30°C下搅拌10-120分钟，其中， 所述冰乙酸的摩尔量是头孢噻呋钠摩尔量的1~3倍;再加入水，用二氯甲烷萃取，旋干有机 相，得到淡粉红色固体;将淡粉红色固体溶于DMF中，加入碳酸钾及溴丙酸，35~45°C下反应2 ~8小时，采用二氯甲烷萃取过柱提纯得所述头孢噻呋半抗原;利用碳二亚胺法将所述头孢 噻呋半抗原与载体蛋白牛血清偶联，制备得到头孢噻呋免疫抗原； 优选的，所述头孢噻呋免疫抗原的制备步骤为将所述头孢噻呋半抗原与DCC、NHS混合， 于4°C下搅拌，离心后取上清液;将人血清蛋白溶于pH值为8.0的PB