一种细粒棘球蚴小动物活体内成像模型及其构建方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种细粒棘球蝴小动物活体内成像模型及其构建方法。
【背景技术】
[0002]细粒棘球蝴是一种常见的人畜共患疾病，不但对公众的健康带来危害还会影响经济的发展。犬类和狐狸是感染的终宿主，狗摄取含包原头节的囊泡，人通过与狗的接触，或者误食含有虫卵的水源、蔬菜而被感染。感染细粒棘球蝴会引起单个或多脏器的损害，寄生器官主要包括肝脏(70%)、肺(20%)，还有10%的可能寄生在身体的任何部位(比如大脑和肌肉组织)。包虫病的地理分布较广，主要集中在欧亚大陆的部分地区，包括地中海地区、俄罗斯、中亚、中国的中西部、澳大利亚、美国(特别是南部)，以及非洲东北地区。目前针对包虫病主要有四种治疗手段:(I)手术切除，(2)对囊泡穿刺抽吸，(3)阿苯达唑(ABZ)或甲苯咪唑(MBZ)药物化疗，(4)保守监测。手术切除是目前最为有效的治疗手段，可以达到根治的目的，但复发率较高。药物治疗对包虫病具有一定的疗效，但长期服用，药物的毒副作用对肾脏和肝脏影响较大。所以，相关药物的研发对根治包虫病具有重要的作用。常规的动物实验往往依赖于病理学的解剖分离和显微镜下的静态观察，然而，这些技术繁琐、费力，而且不可避免的需要处死实验动物，无法完成系统的活体动物内的药敏实验。所以构建一个支持长时间动态检测的活体内小动物感染模型非常的重要。二甲双胍，作为二型糖尿病的一线临床处方药，在近年的研究中获得了新的关注，大量的体外实验已经证明其具有潜在的抗肿瘤作用，而相关机制仍在进一步的研究中。相关的回顾性研究表明，长期服用二甲双胍的糖尿病患者其肿瘤的患病风险(例如，乳腺癌、卵巢癌)比相应的化疗患者更低。所以，尝试研究在体外二甲双胍是否具有一定的抗包虫作用。荧光成像技术是一种新兴的活体内成像技术，它具有着敏感度高、安全易操作、结果直观、数据真实可靠、费用低廉等特点，因此在短短的几年里，已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等各个领域。荧光成像是采用荧光报告基因(GFP、RFP)或荧光染料进行标记，利用荧光蛋白或染料产生的荧光就可以形成体内的荧光光源。荧光成像技术的优势在于对活细胞进行动态荧光观察与成像，还可以标记在其他需要研究的物质上，如药物、特定的生物分子等，示踪其活动及作用，在生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势。
[0003]然而，细粒棘球蝴小动物活体内成像模型在生物领域内仍是空白。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种细粒棘球蝴小动物活体内成像模型及其构建方法，旨在解决细粒棘球蝴小动物活体内成像模型在生物领域内仍是空白的问题。
[0005]本发明是这样实现的，一种细粒棘球蝴小动物活体内成像模型，所述细粒棘球蝴小动物活体内成像模型用实验动物脱毛膏对小鼠进行预处理，每只CF-1小鼠腹腔注射
0.1ml浓度5%水合氯醛麻醉剂，麻醉后清除小鼠胸腹部及四肢的体毛，在小鼠放置在消毒的工作台上，固定四肢，用2%碘伏对手术区域进行消毒处理，采用无菌眼科剪切开皮层与肌层，暴露肝脏，将三组染色后的头节用Iml注射器注射种植在肝被膜下，形成液状囊泡;使用手术缝合线缝合关闭腹部，所有的操作都在无菌条件下进行;将小鼠按照注射的不同组的原头蝴分为三组，在对照组中，小鼠肝内注射的是未进行药物处理的原头蝴，注射后的小鼠用IVIS系统每12小时采集一次图像，绿色荧光激发、发射波长为485nm和538nm，红色荧光激发、发射波长为485nm和590nm，并对ROI s区域进行荧光强度分析;每一个模型小鼠在麻醉前禁食水24小时，每次成像后置于温度为35摄氏度左右的聚乙烯笼中，在阳性对照组中进行了体外荧光梯度检测。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种所述细粒棘球蝴小动物活体内成像模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤:
[0007]步骤一，CF-1雄性小鼠28_35g，6_8周龄，每4只饲养在一个聚乙烯小鼠笼内，实验室温度控制在±20°C，湿度55% ±5%，每五天清洁鼠笼并装换垫料，每日提供饲料及饮水，每只小鼠造模前禁食水24小时；
[0008]步骤二，在无菌条件下从患羊的肝脏中提取原头蝴，清洗后无菌培养37°C、5%CO2，将15μΜ阿苯达唑和1mM二甲双胍分别加入不同组原头蝴的培养基中，再将二者混合剂加入到另一组原头蝴培养基中，在37°C、5%⑶2培养5天，每日定时采用伊红染色并在倒置荧光显微镜下观测头节的活性，每组的至少选取三个培养基进行活性检测，并重复三次，利用JC-1染料线粒体膜电位指示剂对头节进行染色，通过线粒体膜电位的变化来检测头节的凋亡水平；
[0009]步骤三，将头节分为对照组，二甲双胍处理组与二甲双胍与阿苯达唑混合剂药物联合处理组置于24孔板中，染色前用0.0lmol/L灭菌PBS缓冲液在室温下将对照组与实验组3000/孔的头节漂洗三次，然后每组头节中加入10yL的JC-1染料，用铝箔纸包裹孔板，振荡，室温下孵育，染色后用20mM HEPES缓冲液漂洗;然后将染色后的头节转移至35毫米的激光共聚焦显微镜培养皿中1000/孔，用共聚焦显微镜采集图像，在每组头节中随机选取10个原头蝴，并通过Image J软件处理图像并进行红/绿荧光强度分析；
[0010]步骤四，将每组染色后的头节置于24孔板中，使用小动物活体成像仪IVIS系统采集图像，绿色荧光的激发波长与发射波长分别为514nm和529nm，红色荧光激发波长与发射波长为585nm和590nm，在相同的成像条件下，在染色后的48小时内对三组原头蝴进行连续的培养与成像，并绘制了荧光强度信号的变化趋势图；
[0011]步骤五，用实验动物脱毛膏对小鼠进行预处理，每只CF-1小鼠腹腔注射0.1ml浓度5%水合氯醛麻醉剂，待彻底麻醉后清除小鼠胸腹部及四肢的体毛，在小鼠放置在消毒的工作台上，固定四肢，用2%碘伏对手术区域进行消毒处理，采用无菌眼科剪切开皮层与肌层，暴露肝脏，将三组染色后的头节用Iml注射器注射种植在肝被膜下，形成液状囊泡;使用手术缝合线缝合关闭腹部，所有的操作都在无菌条件下进行;将小鼠按照注射的不同组的原头蝴分为三组，在对照组中，小鼠肝内注射的是未进行药物处理的原头蝴，注射后的小鼠用IVIS系统每12小时采集一次图像，并对ROIs区域进行荧光强度分析，每一个模型小鼠在麻醉前禁食水24小时，每次成像后置于温度为35摄氏度左右的聚乙烯笼中，在阳性对照组中进行了体外荧光梯度检测。
[0012]进一步，所述步骤三用铝箔纸包裹孔板，振荡3min，室温下孵育30min，染色后用20mM HEPES缓冲液漂洗3次，pH 7.2。
[0013]进一步，所述步骤五注射后的小鼠用IVIS系统每12小时采集一次图像，绿色荧光激发、发射波长为485nm和538nm，红色荧光激发、发射波长为485nm和590nm，并对ROIs区域进行荧光强度分析。
[0014]本发明的另一目的在于提供一种包含所述细粒棘球蝴小动物活体内成像模型的活体内药敏试验平台。
[0015]本发明的另一目的在于提供一种包含所述细粒棘球蝴小动物活体内成像模型的监测活体模型动态系统。
[0016]本发明提供的细粒棘球蝴小动物活体内成像模型及其构建方法，与现有技术相比，具有以下优势:
[0017]1、细粒棘球蝴是一种广泛分布的人畜共患寄生虫病，在世界很多地区仍具有较高的发病率和死亡率。目前的相关研究主要集中在免疫学、流行病学、手术切除和药物治疗方面，在方法学上仍然比较单一繁琐，且缺乏一种支持动态研究的活体内动物模型，本发明首次尝试构建一