多肽修饰的聚(甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-co-蟾毒灵)纳米制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤靶向递送与缓释给药系统技术领域，涉及一种多肽修饰的聚（甲 基丙烯酸寡聚乙二醇酯-CO-蟾毒灵）纳米制剂及其制备方法。尤其是一种缬氨酸-精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽（cRGD)修饰的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Co-蟾 毒灵）纳米粒(简称P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了蟾毒灵（bufalin)是蟾蜍毒素中的主要有效成分，对多种恶性肿 瘤具有良好的治疗效果，但是，其较强的毒副作用和不溶于水的缺陷极大地限制了其在临 床上的广泛应用。近几十年来，合成纳米材料载体的靶向递送系统由于其独特的优势而备 受国内外关注，将药物包裹在靶向递送载体可以有效地降低药物的毒副作用，提高药物的 溶解性，增强药物的靶向性，改善治疗效果。若干生物降解材料如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙 酸、聚己内酯、聚乙二醇等已经广泛的被用做药物的递送载体，取得了一定的治疗效果。
[0003] 现有技术公开了蟾毒灵纳米制剂常以物理包埋的方式制备（Peihao Yin，et al. Bufalin-Ioaded mPEG-PLGA-PLL-cRGD nanoparticles: preparation, cellular uptake, tissue distribution, and anticancer activity, International Journal of Nanomedicine 2012，7:3961-3969)。所述物理包埋法有操作简单、药物损失率低、适用范 围广泛等优点，但其通常存在药物不可控释放、药物附载率低（一般小于10%)等严重缺陷。 实践显示，物理包埋法制得的纳米药物中，蟾毒灵与纳米载体间是依靠疏水-疏水相互作 用较弱的作用力以一种松散的聚集体的形式存在，在外界环境发生剧烈改变时如静脉注射 时产生的剪切力、循环过程中导致的剧烈稀释等常常造成疏水-疏水相互作用被破坏，导 致蟾毒灵与纳米载体分离。该种药物的早释现象使得纳米载体无法充分发挥其应有的优 势，致使纳米药物制剂的疗效改善有很大的提升空间。
[0004] 为了克服现有技术制备的药物制剂中蟾毒灵过早释放、包载率低等不足，本申请 的发明人拟采用化学改性的方法，利用化学键这种强的作用力将多个蟾毒灵分子与纳米载 体连接起来，提供一种新的多肽修饰的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Ct蟾毒灵）纳米制 剂的制备方法，其中以P (OEGMA-Cf BSMA)为基础材料采用酯化与氨解反应将CRGD和蟾毒 灵共价改性到聚合物上得到P(OEGMA-CrRGD-Ctbufalin);使制得的附载蟾毒灵的肿瘤 靶向纳米药物能有效降低蟾毒灵的毒副作用、提高水溶性和肿瘤靶向性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种多肽修饰的聚（甲基丙烯酸寡聚 乙二醇酯-Ct蟾毒灵）纳米制剂及其制备方法。尤其是一种缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸-谷氨酸环肽（cRGD)修饰的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Ct蟾毒灵）纳米粒(简 称 P(OEGMA-CtRGD-CiHxifalin)及其制备方法。
[0006] 本发明中，以P(Oegm-C^bsma)为基础材料采用酯化与氨解反应将cRGD和蟾毒 灵共价改性到聚合物上制得多肽修饰的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯蟾毒灵）纳米 制剂（以下简称？邮6獻-^〇-1〇-^〇-131^1;[11))。制得的肿瘤革巴向纳米药物能有效降低其中 的蟾毒灵的毒副作用、提高水溶性和肿瘤靶向性；其中的POEGM的长链能使纳米载体有效 的逃逸网状内皮系统的吞噬，从而达到长循环的目的，有助于取得较好的治疗效果；同时， 使其中的革巴向分子cRGD有效的发挥其对肿瘤血管的革巴向效果。
[0007] 本发明的多肽修饰的聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Ct蟾毒灵）纳米制剂为共 价连接蟾毒灵、cR⑶修饰的纳米粒，(简称P(OEGMA-CtRGD-CiHxifalin))，其中，POEGMA具 有长循环功效，cRGD是能够有效主动靶向肿瘤血管的靶向肽，蟾毒灵以其不溶于水的特 点形成纳米粒子的疏水核。该给药系统还具有运送不同抗癌药物的功能。
[0008] 进一步，本发明的提供了一种缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽 (cRGD)修饰和蟾毒灵共价连接的聚合物（P(OEGM-CtRGD-CiHxifalin))的制备方法。
[0009] 本发明的还提供了（cRGD)修饰和蟾毒灵共价连接的药物为疏水核的胶束纳米粒 子的制备方法。
[0010] 本发明要解决的技术问题在于，有效的将蟾毒灵连接到聚合物载体上，使之能够 有效避免传统物理包埋蟾毒灵的方法在体内运输过程中的早释问题，从而最大限度地发挥 药物疗效。
[0011] 本发明所述的 P(OEGMA-CtRGD-CiHxifalin)纳米粒子是以 P (OEGMA-Ct BSMA) 为载体，以蟾毒灵为模型药制成共价连接蟾毒灵的纳米药物，其粒径为10-2000 nm。
[0012] 本发明所述的P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)聚合物的合成方法包括步骤： (1) 制备 BSM : 将一定量巯基乙醇、三乙胺和丙烯酸叔丁酯溶于有机溶剂中，室温搅拌，点板跟踪反应 进程，最后采用柱层析的方式纯化产物；所述的巯基乙醇、三乙胺和丙烯酸叔丁酯的摩尔比 为1 :0. 1-5 :0. 5-2. 0 ;所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、DMF、NMP和DMSO中一种 或两种及以上组合； 将一定量所得产物与三乙胺溶于有机溶剂中，将一定量甲基丙烯酰氯滴加到溶液中， 点板跟踪反应进程，最后采用柱层析的方式纯化产物；所述第一步产物、三乙胺和甲基丙烯 酰氯的摩尔比为1 :〇. 1-5 :0. 5-2. 0 ;所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、DMF、NMP 和DMSO中一种或两种及以上组合； 将一定量所得产物溶于二氯甲烷中，然后加入三氟乙酸，点板跟踪反应进程，最后采用 柱层析的方式纯化产物； (2) 制备 Ph-Br 将一定量Ph-OH和三乙胺溶于有机溶剂中，之后转移至冰水浴中，然后将一定量2-溴 异丁酰溴滴加到溶液中，点板跟踪反应进程，最后采用柱层析的方式纯化产物；所述的 Ph-ΟΗ、三乙胺和2-溴异丁酰溴的摩尔比为1 :0· 5-10 :0· 5-10 ; (3) 制备 P(OEGMA-co-BSMA): 将一定量Ph-Br、0EGMA、BSMA、溶剂和铜盐配体加入玻璃管中，真空冻融三次后加入 铜盐，再真空冻融两次，然后封管；在20-80°C条件下反应0. 5-20小时；所述溶剂为DMF、 DMS0、NMP、异丙醇、甲醇、乙醇和四氢呋喃中的一种或两种及以上组合；所述铜盐配体包括 联吡啶、PMDETA和Me6TREN等；所述？11-8广(^嫩、6嫩、铜盐和铜盐配体摩尔比为1:10-200 : 0. 5-20 :0. 1-10 :0. 1-10 ;反应产物可以进行纯化：过硅胶柱除去铜盐，浓缩，加冰乙醚/正 己烷沉淀出产物，过滤，真空干燥； (4)制备 P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin): 将一定量P(OEGMA-co-BSMA)、NHS-OH、bufalin、DCC和DMAP溶于有机溶剂中室温搅 拌1-72小时，然后加入一定量RGD-NH^t续反应1-24小时，所述P (OEGMA-co-BSMA)中 的 BSMA 和 NHS-OH、bufalin、DCC、DMAP 和 RGD-NH2的摩尔比为 1 :0· 01-0. 1 :0· 1-0. 99 : 1-10 :0. 01-0. 5,反应产物可以进行纯化：加冰乙醚/正己烷沉淀出产物，过滤，真空干燥得 P(Y)RrTMA-n〇-RrTD-n〇-hi]fa1 in)麽合物"
P(DEGMA^o-bufalin-co-RGD)
[0013] 本发明中，采用机械搅拌、超声、高压均质机作用方法制备所述的 P(OEGMA-CtRGD-CiHxifalin)纳米粒，其粒径为10~2000 nm、表面光滑、均匀度好、颗粒 规则无粘连、再分散性好、载药率和包封率高； 所述的P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)纳米粒可用于制备静脉或肌肉注射或口服给药 的缓释纳米粒，作为肿瘤靶向给药；制备的纳米粒可以分散在固体、半固体或溶液中，优选 的是制成注射给药的药物制剂形式，尤其是供静脉注射用。 本发明的实施例中，可分别采用复乳法、薄膜乳化法、、乳化蒸发法、界面沉淀法或自组 装法制备得纳米粒溶液。
[0014] 更进一步的，本发明提供了所述的P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)纳米给药系 统的制备方法，其特征在于，所用的材料是P (OEGMA-c^RGD-c^bufalin)，其摩尔浓度为 0.001-30 g/L ； 其中，所述药物是bufalin，其摩尔浓度为0. 001-10000 μΜ ; 所采用的超声强度，其范围为10-1000 W ; 所用的透析袋截留分子量，其范围为100-10000 Da; 所述的水分散介质为右旋糖昔40-70、pluronic F68或聚乙烯醇PVA等各种适合于制 备纳米粒的表面活性剂，分散介质浓度为0.01-10% (w/v); 所述的有机溶剂包括乙酸乙醋、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇和二甲亚砜等各种适 合于制备纳米粒的有机溶剂。
[0015] 本发明所述的P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin)纳米给药系统可制备成冻干剂保存 和应用，其中采用的冻干支架剂包括海藻糖、葡萄糖、乳糖、煎糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇 和聚乙二醇等，支架剂含量为0. 01-20% (w/v)。
[0016] 本发明制得的P(OEGM-CrRGD-Ctbufalin)纳米给药系统具有良好的靶向能力 和治疗效果，能将药物准确递送至靶点并取得良好治疗效果；所制备的纳米药物直径可保 持在10-500 nm之间；实验证实，所述的纳米粒上的cRGD祀向基团可以与祀点特异性结合， 具有受体介导的靶向给药系统形成的主动靶向效应，使蟾毒灵抗肿瘤药物较准确送到肿瘤 细胞中，实现恶性肿瘤的靶向治疗。
[0017] 本发明制备方法简便，适于大规模生产，尤其适应于制备具有长循环、可生物降 解、缓释、被动靶向、主动靶向、运送活性物质、抗肿瘤的药物，更优选制备抗肠癌的药物。本 发明方法制得的抗肿瘤的药物适用于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服或经 皮给药等方式。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1，制备缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽（CRGD)修饰的 聚（甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-Co-蟾毒灵）纳米粒（P(OEGMA-co-RGD-co-bufalin))， (1) BSMA的制备：将巯基乙醇（5. 0 g)、三乙胺和丙烯酸叔丁酯按摩尔比1 :1 :1溶于 二氯甲烷中，室温搅拌过夜。采用柱层析的方式纯化产物，淋洗剂为二氯甲烷。将所得产物 (5.0 g)