T、BaF3-Y253F、BaF3-T3151细胞生长至对数生 长期后，以5*105cells/ml的浓度转入细胞培养板内培养，给予0μΜ、5μΜ、7. 5μΜ、10μΜ、 15以]?、2(^]\1、3(^]\1薯蓣皂素，连续培养4811，加入1(^1]\0'1'反应液，371：避光孵育411;待 MTT与细胞内琥珀酸脱氢酶充分反应生成甲瓒后加入三联液（50% DMF、20% SDS的水溶 液）裂解细胞，37°C孵育6h溶解甲瓒，于570nm处测定各组的0. D值，以对照组的0. D.为 100%进行细胞活力百分比换算，并用graphpad进行统计学分析，结果如图2所示；
[0029] 采用 20 μ M 的薯蓣皂素干预 K562、BaF3-WT、BaF3-Y253F、BaF3-T315I 细胞，在 Oh、 6h、12h、24h、48h加入10μ1 MTT反应液，37°C避光孵育4h。待MTT与细胞内琥珀酸脱氢酶 充分反应生成甲瓒后加入三联液（50% DMF、20% SDS的水溶液）裂解细胞，37°C孵育6h溶 解甲瓒，于570nm处测定各组的0. D值，以对照组的0. D.为100%进行细胞活力百分比换 算，并用graphpad进行统计学分析，结果如图3所示；
[0030] 实验结果显示，薯蓣皂素具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，且该作用成剂量和时间 依赖性增加。
[0031] 实施例2 :薯蓣皂素诱导肿瘤细胞自噬实验
[0032] 将20 μ M薯蓣皂素处理了 48h的K562、BaF3_WT细胞与对照组细胞用Cyto-ID自 噬体相关蛋白LC3- II蛋白染色试剂染色后通过在激发波长在560nm的激光共聚焦显微镜 下观察，结果如图4所示：经过20ymol/L薯蓣皂素处理了 48h的K562、BaF3-WT细胞的细 胞质内存在更多的绿色荧光斑点，而绿色荧光斑点的多少取决于自噬体相关蛋白LC3- II 的表达水平，因此与对照组相比，薯蓣皂素能显著诱导K562、BaF3-WT细胞的LC3- II表达量 上调，即诱导了两株肿瘤细胞发生自噬；
[0033] 收集经过0 μ M、10 μ M、20 μ M、30 μ M的薯蓣皂素处理48h和经过20 μ M薯蓣皂素 处理0h、12h、24h、48h的Κ562、BaF3-WT细胞，用Western Blot和IP裂解液裂解抽取细胞 总蛋白，进行蛋白定量，按每孔20 yg蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot， 用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果显示，经过薯蓣皂素处理的BaF3-WT、K562细胞 自噬相关蛋白LC3 II的表达量与对照组相比成剂量依赖性和时间依赖性增加，由于LC3 II 的表达量与自噬体的数量成正相关性，LC3 II的表达量越高，细胞自噬也就越活跃（如图5 所示），实验结果表明，薯蓣皂素能显著地诱导K562、BaF3-WT发生细胞自噬。
[0034] 实施例3 :抑制细胞自噬增强薯蓣皂素诱导的肿瘤细胞凋亡实验
[0035] 基于氯喹本身具有弱碱性同时具有趋溶酶体的特性，会破坏溶酶体的酸性环境， 抑制单酰基甘油脂肪酶、磷脂酶A2等酶的活性，使自噬体包裹的长寿命蛋白质等物质不能 被溶酶体降解导致自噬性囊泡在细胞内堆积；和，3-MA是III类磷脂酰肌醇3-激酶的抑制 剂。通过抑制Beclinl-PI3KC3复合物形成来抑制胞浆可溶性形式LC3I向自噬体膜结合形 式LC3 II转化，使LC3 II /LC3I的比值下降，该比值的下降意味着自噬体的形成受到抑制；
[0036] 本实验采用20 μ M的薯蓣皂素干预K562、BaF3-WT细胞，并在给药前Ih加入3-MA 或CQ抑制细胞自噬，连续培养24h后直接加入10 μ I MTT反应液，37°C避光孵育，待MTT与 细胞内琥珀酸脱氢酶充分反应生成甲瓒后加入三联液（50% DMF、20% SDS的水溶液）裂解 细胞，371：孵育611溶解甲瓒，于57011111处测定各组的0.0值，以对照组的0.0.为100%进行 细胞活力百分比换算，并用graphpad进行统计学分析，结果如图6所示：与对照组相比，经 过20 μ M薯蓣皂素干预的K562、BaF3-WT细胞的细胞活力有显著性下降（p〈0. 01)，加入自噬 抑制剂3-MA和CQ的K562、BaF3-WT细胞的细胞活力与单纯薯蓣皂素干预的K562、BaF3-WT 细胞的细胞活力相比，有显著性降低，证明自噬抑制剂和薯蓣皂素的联合给药能增强薯蓣 皂素的药效，并且只加抑制剂3-MA和CQ的组的细胞活力与对照组相比，无显著差异，说明 抑制剂本身对细胞生长无明显抑制作用；因此，实验结果表明，自噬抑制剂和薯蓣皂素的联 合给药所降低的K562、BaF3-WT细胞的细胞活性并非是抑制剂和药物的协同作用所致，而 是由于抑制自噬后增强了薯蓣皂素对K562、BaF3-WT细胞的杀伤效果；
[0037] 本实施例进一步进行细胞自噬在薯蓣皂素诱导肿瘤细胞中发挥的作用试验，并采 用Western-blot检测自噬相关蛋白LC3的表达情况：将各组K562、BaF3-WT细胞于6孔细 胞板内连续培养48h，采用20 μ M的薯蓣皂素干预K562、BaF3-WT细胞，并在给药前Ih加入 3-MA或CQ抑制K562、BaF3-WT细胞的细胞自噬；各组K562、BaF3-WT细胞经过离心收集后 用RIPA裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔20 μ g蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜 进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果显示，经过20 μ M薯蓣皂素 处理的Κ562、BaF3-WT细胞的LC3 II的表达量均高于对照组，且薯蓣皂素与10 μ M CQ联用 组的LC3 II表达量高于单用薯蓣皂素组，薯蓣皂素与2mM 3-MA联用组的LC3 II表达量低于 单用薯蓣皂素组，实验结果表明CQ和3-MA能有效抑制薯蓣皂素诱导的K562、BaF3-WT细胞 的细胞自噬。
【主权项】
1. 含自瞻抑制剂和墓葫皂素的组合药物，其特征在于，所述的组合药物由一种或多种 安全剂量的细胞自瞻抑制剂和式I结构的墓葫皂素组成，2. 按权利要求1所述的含自瞻抑制剂和墓葫皂素的组合药物，其特征在于，所述的细 胞自瞻抑制剂选自3-甲基腺嘿岭（3-魁)、氯哇（化1〇'〇9111116)、1^￥294002或己伐洛霉素 Alo3. 按权利要求1所述的含自瞻抑制剂和墓葫皂素的组合药物，其特征在于，所述的细 胞自瞻抑制剂是氯哇（化Ioroquine)。4. 按权利要求1所述的含自瞻抑制剂和墓葫皂素的组合药物，其特征在于，所述的墓 葫皂素是墓葫皂素或墓葫皂素的衍生物。5. 按权利要求1所述的含自瞻抑制剂和墓葫皂素的组合药物，其特征在于，所述的的 细胞自瞻抑制剂和墓葫皂素采用联合或序贯使用的方式给药。6. 按权利要求1所述的含自瞻抑制剂和墓葫皂素的组合药物，其特征在于，所述组合 药物制成复方药物。7. 权利要求1所述的含自瞻抑制剂和墓葫皂素的组合药物在制备治疗肿瘤的药物中 的用途。8. 按权利要求7的用途，其特征在于，所述的肿瘤是慢性髓系白血病、急性白血病、淋 己瘤、肝癌。9. 权利要求1所述的含自瞻抑制剂和墓葫皂素的组合药物在制备辅助治疗伊马替尼 耐药的肿瘤药物中的用途。
【专利摘要】本发明属医药、生物技术领域。涉及由一种或几种安全剂量的自噬抑制剂与薯蓣皂素组成组合药物及其用途。经体外干预实验显示：薯蓣皂素能够显著抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞凋亡，能诱导肿瘤细胞发生细胞自噬，实验结果表明，细胞自噬在薯蓣皂素杀伤肿瘤细胞中起到保护肿瘤细胞的作用，通过抑制细胞自噬能产生明显增强薯蓣皂素对肿瘤细胞的杀伤效果。本发明的组合药物通过联合或序贯使用方式用于治疗包括慢性髓系白血病、急性白血病、淋巴瘤、肝癌等肿瘤，能明显增强薯蓣皂素杀伤肿瘤细胞的能力，进一部可用于辅助治疗对伊马替尼耐药的肿瘤。采用本发明组合药物可以减少药物的用量，逆转肿瘤细胞的耐药性，降低对人体的毒副作用。
【IPC分类】A61K31/58, A61K45/06, A61K31/4706, A61P35/00, A61P35/02
【公开号】CN105641698
【申请号】
【发明人】叶丽, 姜珊珊, 冯美卿, 鞠佃文
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年9月30日