2日龄健康易感水貂25头(凝集法测抗体效价< 1:4),分为 5组,其中3组各肌肉注射疫苗1.0ml,21日后,B组连同条件相同的对照貂5头,分别接种一个 最小致死剂量的B型LN03株强毒菌液0.2ml进行攻毒,观察14日,结果免疫组的存活率在 100%,而对照组应死亡。G组连同条件相同的对照貂5头,分别接种一个最小致死剂量的G型 SD17株菌液0.2ml,进行攻毒,观察14日,免疫组全部存活,对照组则全部死亡。
[0094] 而且,对比实验表明,用目前市场上出售的水貂绿脓杆菌疫苗进行免疫,再用本发 明筛选的菌株进行攻毒实验;结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明制 成的二价灭活疫苗的效果。
[0095] (2)血清学方法用21~42日龄健康易感水貂5头(凝集法测抗体效价<1:4),各肌 肉注射疫苗1.0ml,21日后,连同条件相同的对照貂5头,采血测定血清中B型/G型水貂绿脓 杆菌抗体效价,免疫貂均的抗体效价2 1:16,对照貂的< 1:4。
[0096] 4.6甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行,符合兽用生物制品通则的有 关规定。
[0097] 实施例3:
[0098]水貂绿脓杆菌B型LN03株和G型SD17株在制备二价灭活疫苗中的应用。
[0099] 分别取菌种保藏编号为保藏编号为CCTCC N0:M2016068的水貂绿脓杆菌B型LN03 株和菌种保藏编号为保藏编号为CCTCC N0:M2016069的水貂绿脓杆菌G型SD17株,活化后分 别接种培养基,培养后收集菌液,经甲醛溶液灭活,与水佐剂混合配制成二价灭活疫苗。 [0100]优选操作步骤如下:
[0101] 2.1菌种选择
[0102] 制苗用菌种其菌落形态、菌体特征、生化特性、培养特性均稳定,对水貂有较强的 致病性,1.0 mL菌液(5.0 X IO6CFlVmL)注射即可导致100 %的21~42日龄水貂发病。免疫原 性良好,最低免疫剂量2 4.0X109。
[0103] 2.2生产用菌种制备
[0104] 2.2.1-级种子繁殖与鉴定:取冻干的菌种,用营养肉汤溶解后,分别接种于含十 六烷三甲基溴化铵的斜面培养基上,37°C培养16小时,取培养物分别划线接种于含十六烷 三甲基溴化铵的平板上,37°C培养16~18小时,各选5~10个典型菌落,分别接种含十六烷 三甲基溴化铵斜面若干支,37°C培养16~18小时,经纯粹检验合格后,作为一级种子。在2-8 °C保存,应不超过7日。在培养基上传代,不超过3代。
[0105] 2.2.2二级种子繁殖:取一级种子,分别接种于含0.3%牛肉膏和2%小牛血清的营 养肉汤培养基,37°C培养16~18小时,取样经纯粹检验合格后,作为二级种子。置2~8°C保 存,应不超过7日。
[0106] 2.3制苗用培养基:为添加0.3%牛肉膏和2%胎牛血清的营养肉汤培养基。
[0107] 2.4制苗用菌液制备
[0108] 2.4.1菌液培养
[0109] 菌液采用微生物发酵罐分别进行培养。
[0110] 按发酵罐容积总量装入70 %的培养基与0.01 %的消泡剂。培养基蒸汽高压灭菌 后,待其温度降至37~38°C时,按培养基总量的2 %~3 %加入二级种子液,开始小量通气, 逐渐增大通气量,调整pH为7.2~7.6,通气量为5~6L/min,搅拌速度控制在100~150转/ 分,37 °C培养16~18小时,收获菌液,置2-8 °C备用。
[0111] 2.4.2纯粹检验与活菌计数
[0112] 菌液培养完成后,分别取样用适宜培养基进行纯粹检验,应纯粹。同时取样进行活 菌计数,每种菌液含活菌数应2 4. 〇 X l〇9CFU/ml。
[0113] 2.4.3 灭活
[0114] 检验合格的菌液,按菌液总量的0.2 %缓慢加入甲醛溶液,充分混合,37 °C灭活24 小时,期间搅拌4~6次。
[0115] 2.4.4半成品检验
[0116] 2.4.4.1 无菌检验
[0117] 按现行《中国兽药典》附录进行,应无菌生长。
[0118] 2.4.4.2灭活检验
[0119] 灭活完成后,取灭活菌液1.0ml接种于含0.3%牛肉膏和2%胎牛血清的100mL营养 肉汤培养基中,37 °C培养24小时,应无菌生长。
[0120] 3二价灭活疫苗的制备
[0121] 按每ml疫苗含灭活的B型LN03株菌数2 4.0 X IO9CFlVml,G型SD17株菌数均2 4.0 X IO9CFUAiI标准,根据预配苗的总量、菌液的菌数结果以及水佐剂的浓度,分别计算出所 需绿脓杆菌B型LN03株菌液、G型SD17株菌液、水佐剂及注射用水的量。先将所需量的注射用 水置配苗乳化罐中,然后加入所需量的绿脓杆菌B型LN03株菌液和G型SD17株菌液,低速 (2000rpm)搅拌5分钟,然后缓慢加入佐剂继续(2000rpm)搅拌15~20分钟,使其充分混合乳 化。
[0122] 3.3半成品检验:按现行《中国兽药典》附录进行,应无菌生长。
[0123] 3.4 分装
[0124] 经无菌检验合格后,定量分装,分装时应随时搅拌,使其混合均匀,加盖密封,并粘 贴标签。
[0125] 4成品检验
[0126] 4.1物理性状
[0127] 本品为乳黄色混悬液,久置后底部有沉淀,振摇后即成均匀混悬液。
[0128] 4.2无菌检验
[0129] 按现行《中国兽药典》附录进行,应无菌生长。
[0130] 4.3装量检验
[0131] 按现行《中国兽药典》附录进行,应符合有关规定。
[0132] 4.4安全检验
[0133] 用21~42日龄健康易感貂5头(凝集法测抗体效价<1:4),各肌肉注射疫苗2.0ml, 观察14日,注射水貂应无不良反应,全部健活。
[0134] 4.5效力检验
[0135] (1)免疫攻毒法用21~42日龄健康易感水貂25头(凝集法测抗体效价< 1:4),分为 5组,其中3组各肌肉注射疫苗1.0ml,21日后,B组连同条件相同的对照貂5头,分别接种一个 最小致死剂量的B型LN03株强毒菌液0.2ml进行攻毒,观察14日,结果免疫组的存活率在 100%,而对照组应死亡。G组连同条件相同的对照貂5头,分别接种一个最小致死剂量的G型 SD17株菌液0.2ml,进行攻毒,观察14日,免疫组全部存活,对照组则全部死亡。
[0136] 而且,对比实验表明,用目前市场上出售的水貂绿脓杆菌疫苗进行免疫,再用本发 明筛选的菌株进行攻毒实验;结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明制 成的二价灭活疫苗的效果。
[0137] (2)血清学方法用21~42日龄健康易感水貂5头(凝集法测抗体效价<1:4),各肌 肉注射疫苗1.0ml,21日后,连同条件相同的对照貂5头,采血测定血清中B型/G型水貂绿脓 杆菌抗体效价,免疫貂均的抗体效价2 1:16,对照貂的< 1:4。
[0138] 4.6甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行,符合兽用生物制品通则的有 关规定。
【主权项】
1. 一种二价水貂绿脓杆菌灭活疫苗,其特征在于,所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗 佐剂,其中使用的抗原为灭活的绿脓杆菌LN03株和灭活的绿脓杆菌SD17株。2. 如权利要求1所述的灭活疫苗,其特征在于,所述的绿脓杆菌LN03株的保藏编号为 CCTCC NO:M2016068。3. 如权利要求1所述的灭活疫苗,其特征在于,所述的绿脓杆菌SD17株的保藏编号为 CCTCC NO:M2016069。4. 如权利要求1所述的灭活疫苗,其特征在于,所述的绿脓杆菌是用甲醛进行灭活的。5. 如权利要求1所述的灭活疫苗,其特征在于,所述的佐剂为蜂胶佐剂或水佐剂。
【专利摘要】本发明提供一种水貂绿脓杆菌二价灭活疫苗,包括有抗原和疫苗佐剂,其中使用的抗原为灭活的水貂绿脓杆菌LN03株和灭活的绿脓杆菌SD17株;其中绿脓杆菌LN03株的保藏编号为CCTCC?NO:M2016068;绿脓杆菌SD17株的保藏编号为CCTCC?NO:M2016069。本发明制备的灭活疫苗安全可靠,能提供有效地同源攻毒保护,免疫后能够产生较强免疫力,接种貂群的发病率和死亡率均明显减少,能够有效预防水貂出血性肺炎的流行和传播,降低本病对毛皮动物养殖业造成的经济损失,有着广阔的应用前景。CCTCC NO:M201606820160222
【IPC分类】A61P31/04, A61P11/00, A61K39/104, A61K39/116, A61K39/39
【公开号】CN105641691
【申请号】
【发明人】单虎, 张洪亮, 盖春云, 黄娟, 张传美, 秦志华, 杨瑞梅, 秦晓冰
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月19日