2)收集步骤(Il)DNA样品进行电泳；
[0070] (13)如步骤1.5所示，对提取到的质粒进行酶切鉴定，而后进行0.8%琼脂糖凝胶 电泳。
[0071] 重组质粒酶切鉴定结果见图3。
[0072]实施例2转化大肠杆菌BL21
[0073] 吸取ΙμL质粒加入100μΙ BL21感受态细胞中，冰浴30min;
[0074] 42 Γ 热激 90s;
[0075] 冰浴 2min;
[0076] 在超净台内加入900μ1无抗性的LB培养液；
[0077] 37°C180rpm摇 Ih;
[0078]吸取100μΙ菌液涂卡那抗性LB平板，37°C过夜培养。
[0079]实施例3大量诱导表达
[0080]挑菌:挑取单克隆至50ml卡那抗性LB培养液中，37°C过夜培养；
[00811转接:按1:100比例转接菌液至500ml卡那抗性LB培养液，共摇3.5L，37°C220rpm培 养 2-2.5h 至 OD6qq 值到0.6;
[0082]诱导：菌液0D_值到0·6后，加入500μ1 IPTG(IM)至IPTG终浓度为lmmol/L，37°C 220rpm诱导培养4h;
[0083] 菌体收集:菌液6 ,OOOrpm离心10min，收集菌体;用40ml PBS清洗菌体，6 ,OOOrpm离 心IOmin，收集菌体，置于-20°C保存；
[0084]实施例4β_溶血素蛋白包涵体制备
[0085] (1)菌体破碎：用裂解液（50mM NaH2P〇4,500mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，用注射器 将菌体吹打均匀，避免块状沉淀物产生；用细胞破碎机Avestin裂解菌液;破碎后离心菌体， 12,000印111，4 <€离心3〇111；[11，弃上清，保留沉淀物；
[0086] (2)将沉淀物重浮于25ml溶液中（裂解液，100μΜ PMSF，IOmM EDTA，IOmM Benzamidine，0·01 %NaN3); 12，000rpm，4°C，离心20min，弃上清，保留沉淀物；
[0087] (3)重复步骤(2)-次；
[0088] (4)将沉淀物重悬于25ml溶液中（裂解液，100μΜ PMSF、IOmM MgCl，IOmM Benzamidene，0·01 %NaN3); 12，000rpm，4°C，离心20min，弃上清，保留沉淀物；
[0089] (5)称沉淀物重量，按Ig/管分装于1.5ml EP管，-2(TC保存。
[0090] 实施例5镍柱亲和层析纯化重组β-溶血素蛋白
[0091] 取Ig包涵体加到30ml变性溶液中（50mM NaH2P〇4,500mMNaCl，8M尿素，pH 8.0)，室 温下搅拌过夜；12，OOOrpm，22°C，离心20min，取上清，吸取20μ1样品待SDS-PAGE检测；
[0092]柱平衡:取4ml Ni-agarose装柱，用变性溶液平衡10个柱体积，排出缓冲液，使液 面高于填料Imm，以免干柱；
[0093]结合:平衡好的填料与样品液混合，冰上摇晃Ih;
[0094] 结合完成后，混合液加入到空柱中，收集Flow through，留20μ1样品检测；
[0095]用30倍柱体积的溶液（50禮恥!12?04,5001111 恥(：1，81尿素，0.1%1^行〇11乂114，口!1 8.0)洗柱至流出液检测不到蛋白为止，随后再用10倍柱体积的变性溶液洗柱，留20μ1检测； [0096] 洗脱:变性溶液中加入咪唑，配制50mM、IOOmM和150mM的咪唑洗脱液，每次用5ml咪 唑洗脱液进行洗脱，每个浓度进行5次洗脱；
[0097] SDS-PAGE分析;结果如图4所示。
[0098]实施例6重组β-溶血素蛋白的复性
[0099] 剪取合适长度透析袋，用透析液(50禮似出?〇4，15〇1111似(：1，？!17.4)浸润，先用透 析夹子夹住一端，再将待复性样品液加入到透析袋中，透析夹子夹住顶端，放置于2L透析液 中，4°C透析12h;
[0?00] 弃去透析液，再加入2L新鲜的透析液，继续透析2h;透析结束后12，OOOrpm，4°C，离 心IOmin，取上清；
[0101 ] BCA法测定蛋白浓度后分装并保存于-80°C ; SDS-PAGE分析结果如图5所示。
[0102] 实施例7重组β-溶血素蛋白亚单位疫苗制备
[0103]按照实验需要，计算疫苗溶液各成分的量，使疫苗中重组β_溶血素蛋白终浓度为 25μg/ml，其中重组β-溶血素蛋白与佐剂ISA 206VG体积比为46:54;
[0104] 将稀释混匀好的重组β_溶血素蛋白溶液及ISA 206VG佐剂放置在恒温水浴锅内加 热至32°C ±1°C，待温度稳定后将抗原加入到佐剂管中，震荡器震荡IOmin进行预乳化；
[0105] 将预乳化完的疫苗放置于盛满冰的烧杯中，固定在预先处理好的超声波细胞破碎 仪上进行乳化；
[0106] 乳化结束后，观察乳化效果:取部分疫苗置于离心管中，3，OOOrpm离心15min，疫苗 不分层为合格；
[0107] 检测合格的疫苗分装到15ml离心管中，标记，封口膜封口，置于4°C保存。
[0108] 实施例8小鼠免疫实验
[0109] 将疫苗拿到室温(25°C)放置，使疫苗温度恢复到常温；
[0110] 给小鼠称重、分组并标记，一组为免疫试验组(n = 6)，免疫β-容血素亚单位疫苗； 另一组为对照组(η = 6)，免疫PBS，并记录数值；
[0111] 用Iml注射器吸取Iml疫苗，左右后腿各注射50μ1疫苗。
[0112] 实施例9小鼠免疫后攻毒实验
[0113] 挑取SA单菌落(菌株为本实验室保存的ΗΒ0911-3菌株)于5ml液体肉汤培养基中， 220rpm、37°C摇菌过夜；
[0114] 按百分之一的体积（Iml)将摇过夜的细菌接种于100mL新鲜液体肉汤培养基中， 220rpm、37°C摇菌过夜；
[0115] 将100mL菌液装入到500ml离心瓶中，8，OOOrpm离心10min，吸去培养基，菌体用 100ml PBS重悬，重复上述步骤3次，最后用5ml PBS重悬混匀；
[0116] 将菌液做10，000倍稀释后计数。根据菌液的浓度，将原菌液稀释到5 X 108CFU/ml (2M LDso);
[0117] 给免疫组和对照组小鼠称重，一组为免疫试验组(n = 6)，另一组为对照组(n = 6) 记录数值；
[0118] 用Iml注射器吸取菌液，按照各浓度细菌对应的小鼠进行尾静脉注射，注射量为 200yl/20g小鼠。
[0119] 连续观察小鼠的生存状况，记录每一只小鼠的死亡时间；攻毒后小鼠存活率结果 如图7所示。
[0120]实施例10ELISA检测β-溶血素抗体效价
[0121] (1)包被:用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)稀释纯化的检测用蛋白至0.5yg/ ml，酶标板上每孔加入IOOyl，封口膜封好后4°C冰箱放置过夜；
[0122] (2)洗涤:从冰箱取出酶标板后，放入洗板机中洗涤，洗涤液用PBST;
[0123] (3)封闭：每孔加入200μ1封闭液(5%脱脂奶），封口膜封好后37°C孵育2h;
[0124] (4)样品准备:按已知的信息和需要用量，用封闭液将血清进行适度稀释；
[0125] (5)洗涤：同（2);
[0126] (6)加样:加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37°C孵育Ih;
[0127] ⑴洗涤：同（2);
[0128] (8)加二抗:每孔加入适度稀释的HRP标记的二抗100μΙ，37°C孵育0.5h;
[0129] (9)洗涤：同（2);
[0130] (10)显色:避光条件下每孔加入100μΙ的TMB显色液，37 °C孵育IOmin;
[0131] (11)终止:每孔加入50μ1终止液(2M的H2S〇4)，终止反应；
[0?32] (12)检测:于450nm波长测定样品OD值，分析数据；
[0133] (13)结果分析:判断抗体阳性的标准:P/N 2 2.1，0D450 2 0.1。
【主权项】
1. 一种奶牛金黄色葡葡球菌β-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用，其特征在于：1) 金黄色葡葡球菌保护性抗原蛋白β-容血素的定点突变与克隆;2)重组β-溶血素蛋白的表达 与纯化;3)将重组β-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球 菌乳房炎重组亚单位疫苗。2. 权利要求1所述的金黄色葡萄球菌保护性抗原蛋白β_溶血素，其特征在于： (a) 由SEQ IDN0.1所示的氨基酸组成的蛋白质； (b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有金黄 色葡萄球菌保护性抗原蛋白溶血素抗原性的由(a)衍生的蛋白质； (c) 重组β-溶血素蛋白表达系统包括但不限于大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞以及昆虫 细胞等。3. 权利要求1所述的奶牛金黄色葡萄球菌β_溶血素亚单位疫苗的制备方法，其特征在 于包括如下步骤： 1) 定点突变金黄色葡萄球菌溶血素蛋白基因； 2) 将定点突变的β_溶血素蛋白基因克隆到pET28a载体中； 3) 将步骤2)获得的表达载体转化E. co 1 i BL21 (DE3)，诱导表达获得重组β-溶血素蛋 白； 4) 使用镍柱亲和层析纯化步骤3)得到的重组β-溶血素蛋白； 5) 将纯化得到的重组β-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂（如ISA 206VG佐剂)充分混 匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。4. 权利要求1所述的亚单位疫苗在预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种奶牛金黄色葡萄球菌β-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用。目的在于提供一种预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)定点突变金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白基因；2)将定点突变的β-溶血素蛋白基因克隆到pET28a载体中；3)将步骤2)获得的表达载体转化E.coli？BL21(DE3)，诱导表达获得重组β-溶血素蛋白；4)使用镍柱亲和层析纯化步骤3)得到的重组β-溶血素蛋白；5)将纯化得到的重组β-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。
【IPC分类】C07K14/31, A61P31/04, A61P15/14, A61K39/085
【公开号】CN105641689
【申请号】
【发明人】钱泓, 吴有强, 宣春玲, 查银河, 贾宝琴, 曹珊珊, 陈藻
【申请人】浙江海隆生物科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月21日