一种由银杏叶提取物形成的中药组合物及其在制备舒血宁注射液中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种由银杏叶提取物形成的中药组合物， 及该组合物在制备舒血宁注射液中的应用。
【背景技术】
[0002] 银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，银杏叶提取物是经现代提取工艺从银杏叶中 提取的活性物质的富集产品，可用于阿尔茨海默病、抑郁症、糖尿病、神经疾病、阳痿、记忆 障碍、外周血管疾病、间歇性跛行、脑转耳鸣等疾病的治疗。其主要活性成分为黄酮类和萜 类。黄酮类成分包括单黄酮、黄酮醇苷、乙酰化黄酮醇苷、双黄酮、黄烷-3-醇类以及原花色 素等。萜类银杏内酯有银杏内酯A、B、C、J、M及白果内酯。
[0003] 目前国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准了数十种银杏叶提取物剂型，包括银 杏叶片、胶囊、颗粒、软胶囊、分散片、丸、酊、滴剂、口服液、银杏叶提取物注射液等，其成药 形式均是将银杏叶提取物与其它辅料混合形成，例如，舒血宁注射液就是将银杏叶提取物 与葡萄糖、乙醇等输料混合形成的一种银杏叶提取物注射液。众所周知，银杏叶提取物是一 个非常复杂的化合物富集产品，除上述主要的活性成分，其含有从无机物到有机物、从极性 到非极性、从小分子到生物大分子的各种成分，据不完全统计银杏叶中含有240多个化学成 分。受技术发展的制约，目前银杏叶提取物中各化学成分并没有完全被确认，且有效成份、 作用机制、药代动力学及不良反应也并没有完全探究清楚。而具有本领域公知常识的技术 人员均知悉，上述提到的作用机制、药代动力学及不良反应均与成药中的化学成分有着必 然的联系。因此，进一步明确银杏叶提取物中的有效成分，并进一步精确有效成分的含量， 提高银杏叶提取物的药效，减少不良反应，对于提高患者健康及其用药安全具有重要的意 义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种有效成分及含量更加明确的银杏叶提取物，并进一步 的提供该提取物的制备方法。
[0005] 为此，本申请采取的技术方案为，
[0006] -种由银杏叶提取物形成的中药组合物，以占所述中药组合物的质量百分比计， 包括，24-40 %的银杏总黄酮，6-16 %的银杏内酯，银杏酸小于5ppm。
[0007] 上述由银杏叶提取物形成的中药组合物中包括，1-1.68%的槲皮素-3-0-葡萄糖 苷，2.11-3.53%的槲皮素-3-0-2"，6" -二鼠李糖基葡萄糖苷。
[0008] 上述由银杏叶提取物形成的中药组合物中包括，1.4-3 %的银杏内酯A，0.9-1.8 % 的银杏内酯B和1.2-1.3%的银杏内酯C。
[0009] 上述由银杏叶提取物形成的中药组合物中，还包括白果内酯和芦丁。
[0010] 上述任一由银杏叶提取物形成的中药组合物的制备方法，包括，
[0011] SI所述槲皮素-3-0-葡萄糖苷的制备方法，
[0012] (1)将银杏叶提取物溶于体积浓度为40-80%的乙醇-水溶液中，制备得到银杏叶 提取物的浓度为10-1 〇〇〇mg/mL的提取物溶液；
[0013] (2)对所述步骤（1)得到的提取物溶液进行一维液相色谱分离，得到一维粗产品， 本步骤中一维液相色谱分离的条件为，色谱柱采用以硅胶为基质的亲水型色谱填料;流动 相中的有机相为乙醇或甲醇，水相为水;洗脱条件以〇_15min有机相95%降至90%梯度进行 或等度进行;收集保留时间为15~20min的组分，去除溶剂干燥得到含有槲皮素-3-0-葡萄 糖苷的一维粗产品和第一剩余品；
[0014] (3)将步骤(2)得到的一维粗产品溶解在体积浓度为40-80%的甲醇-水溶液或乙 醇-水溶液中，得到所述一维粗产品的浓度为20-200mg/mL的粗产品溶液；
[0015] (4)对所述步骤(3)得到的粗产品溶液进行二维液相色谱制备，得到槲皮素-3-0-葡萄糖苷；
[0016] S2所述槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷的制备方法，
[0017] (a)将银杏叶提取物溶于体积浓度为40-80%的乙醇-水溶液中，制备得到银杏叶 提取物的浓度为10-1 〇〇〇mg/mL的提取物溶液；
[0018] (b)对所述步骤(a)得到的提取物溶液进行一维液相色谱分离，得到一维粗产品； 本步骤中一维液相色谱分离的条件为，色谱柱采用以硅胶为基质的亲水型色谱填料;流动 相中的有机相为乙醇或乙腈，水相为水;洗脱条件以〇_15min有机相95%降至90%梯度进行 或等度进行;收集保留时间为28-32min的组分，去除溶剂干燥得到含有槲皮素-3-0-2"，6"-二鼠李糖基葡萄糖苷的一维粗产品和第二剩余品；
[0019] (c)将步骤(b)得到的一维粗产品溶解在体积浓度为40-80%的甲醇-水溶液或乙 醇-水溶液中，得到所述一维粗产品的浓度为20-200mg/mL的粗产品溶液；
[0020] (d)对所述步骤(c)得到的粗产品溶液进行二维液相色谱制备，得到槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷；
[0021 ] S3由银杏叶提取物形成的中药组合物的制备方法
[0022] 将所述第一剩余品和和所述第二剩余品去除容积后混合，并干燥得到辅助品，将 所述辅助品、所述槲皮素-3-0-葡萄糖苷和所述槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷混 合得到所述由银杏叶提取物形成的中药组合物。
[0023] 上述由银杏叶提取物形成的中药组合物的制备方法中，所述步骤(4)中二维液相 色谱条件为，色谱柱采用以硅胶为基质键合C18反相填料;流动相中的有机相为乙醇或甲 醇，水相为水;洗脱条件以0-60min有机相15%增至80%梯度进行或等度进行;收集保留时 间为30-40min的组分，干燥得到槲皮素-3-0-葡萄糖苷。
[0024] 上述由银杏叶提取物形成的中药组合物的制备方法中，所述步骤(d)中二维液相 色谱条件为，色谱柱采用以硅胶为基质键合C18反相填料;流动相中的有机相为乙醇或乙 腈，水相为水;0_60min内等度洗脱，洗脱时有机相的体积浓度为15-25 % ;收集保留时间为 40-45min的组分，干燥得到槲皮素-3-0-2"，6" -二鼠李糖基葡萄糖苷。
[0025] 上述由银杏叶提取物形成的中药组合物的制备方法中，所述步骤(2)中一维液相 色谱分离，有机相还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1 %;水相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为 0.1% ；
[0026] 所述步骤(4)二维液相色谱制备，流动相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1%;水 相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1 %。
[0027] 上述由银杏叶提取物形成的中药组合物的制备方法中，所述步骤(c)中一维液相 色谱分离，有机相还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1 %;水相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为 0.1% ；
[0028] 所述步骤(d)二维液相色谱制备，流动相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1%;水 相中还含有甲酸，甲酸体积浓度为0.1 %。
[0029] 上述任一所述中药组合物在制备舒血宁注射液中的应用。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下优点，
[0031] (1)本发明的银杏叶提取物，将所述银杏总黄酮的含量明确到24-40%，银杏内酯 的含量明确到6-16%，同时明确了两种对其药物具有重要影响的槲皮素-3-0-葡萄糖苷和 槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷，并进一步的将其含量精确限定为1-1.68%和 2.11-3.53 %，进一步的，清楚的界定其银杏内酯Al. 4-3 %，银杏内酯BO. 9-1.8 %和银杏内 酯Cl. 2-1.3%。通过对银杏叶提取物中有效成分含量的进一步精确，及有效成分的进一步 认定，提高了银杏叶提取物的药效，通过实验表明其在冠心病心绞痛及缺血性脑血管病等 方面具有显著的效果。
[0032] (2)本发明中通过对银杏叶提取物进行精制和提纯，得到具有确切含量的组合物， 在提高银杏叶提取物药效的同时，通过上述操作过程减少了杂质，从而减少了不良反应。
[0033] (3)本申请从银杏叶提取物中采用二维液相色谱法分离出明确的药用化合物槲皮 素-3-0-葡萄糖苷和槲皮素-3-0-2"，6"-二鼠李糖基葡萄糖苷，其制备方法简单，分离操作 方便，利于银杏叶提取物药品质量的提尚。
【附图说明】
[0034] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0035] 图1本发明实施例1中制备得到的槲皮素 K-葡萄糖苷的质谱；
[0036] 图2本发明实施例1中制备得到的槲皮素-3-0-葡萄糖苷的H谱；
[0037] 图3本发明实施例1中制备得到的槲皮素-3-0-葡萄糖苷的C谱；
[0038] 图4本发明实施例1中制备得到的槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷的质 谱；
[0039] 图5本发明实施例1中制备得到的槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷的H谱；
[0040] 图6本发明实施例1中制备得到的槲皮素-3-0-2"，6"_二鼠李糖基葡萄糖苷的C谱。
【具体实施方式】
[0041] 本发明实施例中出现的百分数％，如无特殊说明表示的是体积百分数，例如， "40%的乙醇一水溶液"表示乙醇的水溶液其中乙醇的体积百分数为40%;
[0042] "40%的甲醇一水溶液"表示甲醇的水溶液其中甲醇的体积百分数为40% ;
[0043] "乙醇（含0.1 %甲酸）"表示乙醇与甲酸的混合溶液其中甲酸的体积百分数为 0.1 % ; "7K(含〇. 1 %甲酸)"表示水与甲酸的混合溶液其中甲酸的体积百分数为〇. 1 %。
[0044] 本申请的银杏叶提取物适用于采用现有提取工艺从银杏叶中提取得到的提取物， 为便于比较，本申请实施例中采用的银杏叶提取物由北京双鹤高科天然药物有限责任公司 提供。
[0045] 实施例1
[0046] 槲皮素-3-0-葡萄糖苷的制备
[0047] 称取银杏叶提取物IOg，溶于50mL 40%的乙醇一水溶液，制得银杏叶提取物溶液， 浓度为200mg/mL，过0.45μηι微孔滤膜，进行一维液相色谱分离。一维液相色谱采用以硅胶为 基质的亲水型色谱填料50 X 250mm，ΙΟμπι(华谱新创科技有限公司），流动相采用含0.1 %体 积浓度甲酸的甲醇为有机相，含〇. 1%体积浓度甲酸的水为水相，梯度洗脱方式:〇-15min有 机相浓度从95%降至90%台阶梯度进行。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温 度为室温，进样量为500yL/针，流动相流速为90mL/min，收集15~20分钟的组分和剩余组 分，将收集到的15~20分钟的组分进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备槲皮素-3-0-葡萄糖 苷粗品。用50 %的乙醇一水溶液溶解槲皮素-3-0-葡萄糖苷粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤 膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为以硅胶为基质的亲水型色谱填料(50 X 150mm，5μ m，华谱新创科技有限公司）流动相选择含0.1 %体积浓度甲酸的甲醇为有机相，含0.1%体 积浓度甲酸的水为水相，采用0_60min的15-80 %有机相梯度洗脱。采用DAD紫外检测器 360nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为1000 yL/针，流动相流速为90mL/min，收集 保留时间在30-40min的组分，旋转蒸发至干，得到槲皮素-3-0-葡萄糖苷化合物。
[0048]分别采用质谱、1H-NMR和13C-NMR(MeOD)对得到的终产物进行分析，其中质谱、 1H-NMR谱图如图1和2所示，
[0049] 13C-NMR (MeOD)解析如下，
[0050] 槲皮素母环：157.64(C2)，134.24(C3)，178· 10(C4)，161.64(C5)，98.49(C6)， 164.60(C7)，93.32(C8)，157.07(C9)，104.31(C10)，121.69(C1，），114.61(C2,），144·51 (C3'），148.45(C4'），116.18(C5'），121.81(C6'）
[0051] 3-0-葡萄糖：102.95(<：1)，74.34(〇2"），76.98(〇3"），69.83((：4"），76.72(〇5"），