230、254、280、310歷;柱温为30°(：〇
[0039]样品用100%乙醇溶解，在39~42min时间段收集溶液，浓缩干燥后得到消渴安有效 组分0.03 g。
[0040]实施例四消渴安有效组分LC-MS分析 色谱条件：色谱柱Agi lent Zorbax SB_Ci8柱（4.6 mm X 250 mm，5 μπι)。采用梯度洗 脱，流动相A相为0.5%甲酸水溶液，流动相B相为含0.5 %甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序如 T:0min，5%B;20min，20%B;25min，26%B;50min，33%B;60min，40%B;70min，80%B;80min， 100%B。进样量:5 uL;流速:0.5 mL/min;柱温:35°C。
[0041]质谱条件：正负呙子扫描模式，正呙子扫描范围100~1500,负呙子扫描范围300 ~1500;干燥气(N2气)流速10 L/min，离子喷雾电压-3000 V，雾化温度350°C，毛细管电压 3500V，裂解电压100V。
[0042] 供试品溶液的制备:称取消渴安有效组分适量于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻 度，摇勾，1 〇〇〇〇 rpm离心10 min，取上清液制成浓度为1.0 mg/ml的供试品溶液，即得。
[0043] 测定方法:精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱质谱分析条件测 定，即得。结果如图1、图2所示。
[0044] 分析结果:消渴安有效组分的LC-MS离子流图，图中的A峰，是化合物人参皂苷Rg5。 相对保留时间为77.21 min。
[0045] 实施例五中药有效组分制剂 取实施例三的中药有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后 移至滴丸滴灌中，药液滴至6~8°C液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。
[0046]实施例六DPP-4抑制活性的测定 采用课题组建立的DPP-4抑制剂筛选方法，将消渴安有效组分制成O . 5 g/L浓度的溶 液;将阳性药抑二肽素A制成I mmol/L浓度的溶液。取96孔板，加50 ymol/L底物20灿，消渴 安有效成分溶液5仙，0.1 U/mL DPP-4酶溶液5 uL，混匀后37°C下孵育30min，在激发波长 320 nm，发射波长450 nm处测定其荧光强度值。计算消渴安有效组分对DPP-4活性的抑制 率。其中酶溶液，样品溶液，反应底物溶液均以〇. 5mmo 1/L，pH 7.0 HEPES缓冲液配制。
[0047] I样g组:含底物和酶，并且加入待测样品反应后的荧光强度值。
[0048] I样含底物和待测样品，不加酶的荧光强度值。
[0049 ] 1?组:含底物和酶，但不加入待测样品反应后的荧光强度值。
[0050] 1?組:只含有底物，不含酶和待测样品的荧光强度值。
[0051 ]结果如图4所示，阳性药物抑二肽素A在5 ymol/L浓度下抑制率为49.72%。证明本 课题组建立的DPP-4抑制剂筛选方法的可行性。
[0052]相同条件下，消渴安有效组分在25 mg/L浓度下抑制率为96.03 %。
[0053]实施例七人参皂苷Rgd#DPP-4抑制活性的量效考察 取96孔板，加50 ymol/L底物20μL，0.1 U/mL DPP-4酶溶液5 uL以及一定体积浓度为1 mmol/L人参皂苷Rg5溶液，使得人参皂苷Rgd#浓度分别为5、10、25、35、50 ymol/L，反应总体 积为100 UL。混匀后37°C下孵育30min，在激发波长320 nm，发射波长450 nm处测定其荧光 强度值。计算人参皂苷Rg5各浓度对DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，样品溶液，反应底物 溶液均以〇.5mmol/L，pH 7.0 HEPES缓冲液配制。
[0054] 结果如图4所示，人参皂苷1^5在5、10、25、35、50以111〇1/1浓度下抑制率分别为 10.84%、18.83%、68.63%、73.86%、86.87%。
[0055]实施例八人参皂苷Rg5对3T3-L1细胞诱导分化的影响 3T3-L1前脂肪细胞20000个/孔接种于24孔板，每孔I mL培养液。待细胞长满80%左右 后，将培养液换成含1 μΜ地塞米松、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX)、10 yg/mL胰岛 素、10% FBS的高糖DMEM培养液培养2天;随后将培养液换成含10 yg/mL胰岛素、10% FBS的 高糖DMEM培养液培养2天;最后将培养液换成含10% FBS的高糖DMEM培养液，每2天换一次培 养液。诱导分化10-12天后，约80%的3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞。更换诱导液的同时给 予50 μΜ人参皂苷Rg5。
[0056]细胞诱导分化成熟后，弃去旧培养液，PBS漂洗2次，加入4%多聚甲醛固定细胞I h。 之后用PBS漂洗1遍，油红0染色30 min后，70%乙醇水溶液漂洗2次，显微镜下获取图片。结果 如图5所示。
[0057] 实施例九人参皂苷Rg5对胰岛素抵抗BNL CL2细胞葡萄糖消耗作用的影响 小鼠胚胎肝细胞(BNL CL2)20000个/孔接种于96孔板，每孔100 yL培养液。24 h后，将 培养液换成含25 μΜ人参皂苷Rg5、l μΜ胰岛素、不含血清的低糖、无酚红DMEM培养液，实验 另设无细胞空白组（只含低糖、无酚红DMEM培养液）、对照组（不含胰岛素和药液）、模型组 (含1 μΜ胰岛素)和阳性药组(含1 μΜ胰岛素和250 μΜ西他列汀）。孵育24 h后，每孔取10 yL 上清液，用葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法)测定每孔的葡萄糖消耗量。之 后将96孔板中的培养液吸尽，加入含0.5 mg/mL的MTT培养液100 yL，4 h后吸去MTT溶液，加 入100 yL DMSO，580 nm处测定各孔吸光度值。
[0058] 以无细胞空白组的葡萄糖含量减去接种细胞的测试孔中的葡萄糖含量，即得各组 样品的葡萄糖消耗量。同时，除以各组细胞的MTT值进行细胞数量的校正。结果如图6所示， 人参皂苷Rg 5能促进胰岛素抵抗的BNL CL2细胞的葡萄糖消耗。
【主权项】
1. 人参皂苷Rg5作为二肽基肽酶IV抑制剂的用途。2. 人参皂苷Rg5在制备治疗糖尿病药物中的应用。3. -种治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于，包含作为有效成分的人参皂苷Rg5。4. 如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中人参皂苷Rg5的百分 比含量为15~85%。5. 如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，还包括药剂学上接受的药物赋形剂或 载体。6. -种药物组合物的制备方法，其特征在于，取人参皂苷Rg5与聚乙二醇混合均匀，加 热熔融得到混合药液，混合药液滴至液体石蜡中，除油，制得滴丸。7. 如权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，取人参皂苷Rg5 0.5 g与 10.5 g的聚乙二醇混合均匀，加热熔融得到混合药液，混合药液滴至液体石蜡中，除油，制 得滴丸。8. -种人参皂苷Rg5的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将人参粉碎后加入甲醇中，超声提取，获得提取液； (2) 将提取液浓缩成浸膏，与大孔树脂进行拌样，装柱后用乙醇-水洗脱，合并人参皂 苷Rgs流分的洗脱液，浓缩干燥后得粗品； (3) 将粗品溶解在无水乙醇中，采用制备液相色谱纯化，对目标流分进行浓缩、干燥， 得到所述人参皂苷Rg5。9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，依次用水、浓度<40%的乙醇 洗脱杂质，再收集浓度2 95%的乙醇洗脱的洗脱液。10. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，制备液相色谱条件为:色谱 柱填料SB-C18,21.2 mm X 250 mm，7 μπι;流动相为水-乙腈，两者的体积比为70:30,流速为 5~10 mL/min;柱温为25~35°C ;收集39~42min时间段内的流分即为目标流分。
【专利摘要】本发明公开了人参皂苷Rg5作为二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的用途及其在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明还公开了一种治疗糖尿病的药物组合物，包含作为有效成分的人参皂苷Rg5。本发明还公开了一种药物组合物的制备方法。中药有效成分人参皂苷Rg5具有抑制DPP-4活性的作用，为糖尿病的防治提供新的药物选择。本发明还公开了一人参皂苷Rg5的制备方法，采用大孔树脂与制备液相色谱相结合的提取工艺，可以快速准确地得到人参皂苷Rg5。
【IPC分类】A61K31/704, C07J17/00, A61K9/20, A61P3/10
【公开号】CN105640972
【申请号】
【发明人】赵筱萍, 王毅, 邹敬韬, 盖男, 田旭辉, 陈家骄, 黄小萍, 邓昌瑞, 王凤玉, 陈 峰, 刘东辉
【申请人】通化华夏药业有限责任公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月20日