利用包含含蛋白膜囊泡的抗原组合物制备多克隆抗体的方法
【专利说明】利用包含含蛋白膜囊泡的抗原组合物制备多克隆抗体的方法
【背景技术】
[0001] 在诊断学和治疗学中抗体是强大和非常宝贵的工具。根据高特异性抗体的需求不 断增长，随着时间已开发许多不同策略W允许可靠地生产足量的抗体（参见例如， J. S.Haurum，Drug Discove巧 Today，2006.11 (13-14)，655-660)。在运种背景下，1975年杂 交瘤技术的发现代表重大突破，因为小鼠杂交瘤是单克隆抗体的第一种可靠来源。
[0002] 在理论上，可W针对选定的任何祀标开发单克隆抗体。选定的祀标的提供是绝对 必要的。即使在基因免疫的情况下，也需要抗原用于筛选和证实目的。不幸的是，在某些情 况下，如果在基于细胞的测定中抗原分离或制备均不成功，则抗原的提供可能成为问题。
[0003] 通常，抗原属于蛋白和肤的类别，但是原则上其他物质类别也可W用作免疫原，例 如多糖、脂质和多核巧酸。在大多数情况下，应当针对天然抗原产生抗体。如果抗原是通过 重组DNA技术产生的，则比较所得的重组蛋白或肤与其天然对应物的特性是非常重要的，因 为蛋白结构的差异可W导致免疫原性的差异。对于抗体制备，蛋白和肤是高度感兴趣的祀 标。鉴于免疫原性表位是线性的且不依赖于完整蛋白的=级结构的事实，肤合成代表基于 细胞的表达的另一种选择。在另一方面，肤合成具有其局限性，因为蛋白和肤具有翻译后修 饰(PTM)，运是S维表位的部分。此外，使用肤和肤混合物作为抗原可W诱导产生交叉反应 性抗体。
[0004] 膜蛋白占所有测序的基因组的近=分之一。与它们在细胞过程如信号传导、代谢、 转运和识别中的重要参与相反，关于膜蛋白结构和功能性可获得的信息很少。在体内它们 生物学活性的下调可W导致严重疾病，使得它们成为高度感兴趣的药理学祀标。运种发展 引起对膜蛋白特异性抗体的需求增加。
[0005] 针对膜蛋白的特异性抗体的产生常受到不能制备或分离某种祀膜蛋白的限制。在 体内过量表达膜蛋白常受到蛋白错误折叠、不溶性、聚集、低产率和细胞毒性的妨碍。但是， 膜蛋白的无细胞表达可W克服运些障碍。
[0006] 在过去的十年里，无细胞蛋白合成已成为制备包括膜蛋白、胞质蛋白或甚至毒性 蛋白在内的不同蛋白类别的有价值的工具（参见例如，Katzen etal. ,Trends Biotechnol. ,2005.23(3) ,150-156)。高效无细胞表达系统的基础是具翻译活性的细胞提 取物，其包含翻译的必要组分如核糖体、翻译因子和酶。此外，细胞裂解物补充了氨基酸、 ATP和GTP和能量再生系统(例如肌酸-憐酸/肌酸-激酶能量-再生系统）。祀蛋白的合成通过 添加 DNA或mRNA形式的适当模板来起始。到目前为止，已在原核和真核无细胞系统中表达许 多不同类型的功能活性祀蛋白。与原核细胞提取物相比，真核细胞裂解物在表达需要翻译 后修饰的复杂蛋白中提供几个优势。
[0007] 然而，使用通过原核和真核细胞裂解物合成的蛋白根据现有技术的常规方法制备 特异性抗体仍设及额外的费力的纯化和/或分离步骤，W便提供合适形式的期望祀蛋白用 作免疫原性物质。
[000引鉴于现有技术的缺点，本发明的主要目的是提供改进的方法和手段用于制备针对 特定祀蛋白的多克隆抗体。
[0009] 运个目的已通过提供制备针对特定祀蛋白的多克隆抗体的新方法实现，所述方法 利用包含权利要求1和2的含蛋白膜囊泡的抗原组合物进行制备。本发明的其他方面和更多 具体实施方案是其他权利要求的主题。
【发明内容】
[0010] 根据权利要求1制备针对抗原祀蛋白的多克隆抗体的方法包括通过向宿主施用包 含渗有所述抗原祀蛋白的膜囊泡的免疫原性组合物来在所述宿主中诱导免疫反应，W及从 所述宿主血清获得针对所述祀蛋白的抗体。
[0011] 根据权利要求2的更具体的方法至少包括W下步骤：
[0012] a)通过体外翻译反应在反应介质中合成所述祀蛋白，所述反应介质包含编码所述 祀蛋白的核酸模板和含有膜囊泡的细胞裂解物；
[0013] b)从所述介质分离包含所合成的祀蛋白的膜囊泡；
[0014] C)在生理上相容的介质中提供包含所合成的祀蛋白的膜囊泡；
[0015] d)向宿主施用步骤C)的膜囊泡；
[0016] e)测试所述宿主的血清样品针对所述祀蛋白的特异性免疫反应;W及
[0017] f)从表现出针对所述祀蛋白的特异性免疫反应的宿主的血清获得针对所述祀蛋 白的特异性抗体。
[0018] 本发明人的研究令人惊讶地证实可W使用渗有至少一种祀蛋白的膜囊泡的制品， 直接作为免疫原性组合物用于在宿主中产生针对祀蛋白的特异性抗体。运样的膜囊泡制品 对于宿主基本上是无毒的，并且可W用来有利地诱导强免疫反应而不添加任何其他免疫刺 激剂。
[0019] 合适的膜囊泡制品是例如运样获得的，在包含编码祀蛋白的核酸模板和包含膜囊 泡的细胞裂解物的反应介质中进行无细胞翻译反应，并且在翻译反应之后从所述介质分离 含蛋白的囊泡。
[0020] 优选地，所述细胞裂解物为真核细胞裂解物。
[0021] 不特别限制所述真核细胞裂解物，原则上可W是任何细胞裂解物，其包含所使用 的核酸模板的体外翻译W及任选地所合成祀蛋白的修饰所需要的所有组分。
[0022] 更具体地，所述真核细胞裂解物选自小麦胚芽裂解物，昆虫细胞裂解物特别是 Sf 21细胞裂解物，网织红细胞裂解物，角质形成细胞裂解物，来自CHO细胞、HeLa细胞、骨髓 瘤细胞、杂交瘤细胞或培养的淋己瘤细胞的细胞提取物。
[0023] 运些细胞裂解物可W W它们的天然形式使用，或者通过添加或去除特定组分进行 修饰。
[0024] 下文实例中使用的无细胞系统是基于产生自培养的昆虫细胞（草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)，Sf21)的具翻译活性的裂解物。通过保留亚细胞组分完整性的 非常溫和的裂解物制备方法，内质网化R)的重要部分可W保留在裂解物中作为功能活性膜 囊泡。利用含有囊泡类型的裂解物，可W对祀蛋白进行翻译后修饰(PTM)如糖基化、信号肤 切割、脂质化、憐酸化和二硫键形成。
[0025] 如果获得自特定细胞系的原始细胞裂解物不含膜囊泡(例如网织红细胞裂解物）， 则可W添加来自不同来源的囊泡，例如来自不同细胞系的裂解物。
[0026] 优选地，膜囊泡和细胞裂解物源自相同细胞系。
[0027] 此外，还可W使用其中一种或多种组分已合成制备的人工细胞裂解物。
[0028] 用于体外翻译反应的反应介质包含所述裂解物，所述裂解物包含翻译的必要组分 如核糖体、翻译因子和酶。此外，所述介质或细胞裂解物补充了氨基酸、ATP和GTP和能量再 生系统(例如肌酸-憐酸/肌酸-激酶能量-再生系统）。祀蛋白的合成通过添加 DNA或mRNA形 式的祀蛋白的适当核酸模板来起始。
[0029] 包含合成的祀蛋白的膜囊泡可W通过本领域已知的任何合适的方法自反应介质 分离，特别是通过离屯、或过滤的方式。
[0030] 在本发明的一优选实施方式中，步骤a)的体外翻译反应在促进膜囊泡中合成祀蛋 白的富集的条件下发生。
[0031] 获得运样的膜囊泡中合成祀蛋白的富集的一种示例性方法包括权利要求2的方法 的修改，其中权利要求2的步骤b)之后是额外的步骤b')，其包括将分离的膜囊泡转移入第 二反应介质，所述第二反应介质包含编码祀蛋白的核酸模板和不含膜囊泡的细胞裂解物， 在所述第二反应介质中进行体外翻译反应，W及从第二介质分离包含增加量的合成祀蛋白 的膜囊泡，其中步骤b'可W重复一次或多次。
[0032] 在一可选实施方式中，步骤a)中的体外翻译反应是通过基于连续透析的方法进行 的，所述方法包括在翻译反应的过程中添加和/或排出反应物或产物。运种反应形式延长反 应时间，因此增加总蛋白产率。
[0033] 通常，运个实施方式在包含至少2个通过透析膜分隔的隔室的装置中实现，其中翻 译反应在至少一个第一隔室，反应隔室中发生，并且在翻