一种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽用医药生物领域，具体涉及一种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法。
【背景技术】
[0002]近年来，国家对家禽禽流感强制免疫和养殖业相关人员对禽流感防控的高度重视，我国禽流感疫情总体上呈逐年下降的趋势。但目前，无论是高致病性禽流感还是低致病性禽流感，仍然是严重威胁养禽业的大敌。自2004年以来，中国内地相继暴发高致病性禽流感，不仅沉重打击了国内的养禽业，而且对我国的经济和贸易发展也造成了严重的影响。
[0003]自1933年利用鸡胚培养流感病毒获得成功以来，鸡胚就成为人们大量获得流感病毒的主要来源。但是用鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异，而且鸡胚残留物还可能引起过敏性反应。鸡胚作为疫苗生产基质，还存在大规模生产时供给困难和潜在的外源病毒污染问题。
[0004]近年来，随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播，人们认识到需要研究一种可在流感大规模流行时能够替代鸡胚，快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。应用MDCK细胞系培养流感病毒不仅解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染的问题，而且培养的病毒免疫原性更为稳定。
[0005]兽医生物制品生产中的灭活，是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗；或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。
[0006]灭活剂具有特异性，某些灭活剂只对一部分微生物有明显的灭活作用，不同的灭活剂对同一种微生物的灭活效果也不同，如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%的石炭酸溶液于数小时内能杀死细菌的芽孢;真菌和病毒对酚类不太敏感。
[0007]因此在禽流感病毒灭活疫苗生产过程中，就需要对抗原的灭活进行灭活检验，以确定抗原是否灭活完全，从而避免灭活不完全的疫苗造成生物安全隐患。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法，该方法可稳定，准确地检验禽流感抗原的灭活情况，应用于禽流感病毒灭活疫苗的生产检验。
[0009]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法，包括以下步骤:
1)取至少3瓶细胞瓶培养MDCK细胞24-30h，MDCK细胞生长密度达80%以上时，弃去生长液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤细胞瓶3_4次；
2)向各细胞瓶中分别加入Iml含胰酶的DMEM培养液，室温放置15_20min，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为25-50yg /ml；
3)将灭活后的禽流感抗原液做10倍稀释后，各取1-1.5mL分别接种于各个细胞瓶中，将细胞瓶置于35°C的CO2培养箱中孵育30-35min，使灭活后的禽流感抗原液在MDCK细胞上吸附，期间振摇1-2次，所述CO2培养箱中CO2的浓度为5%;
4)吸附后，在各细胞瓶中分别加入8-10mlDMEM培养液，将细胞瓶继续置于上述0)2培养箱中继续培养5天后，收获细胞培养液，并反复冻融3次，此为盲传第I代；
5)取至少3瓶已生长24-30h，并且生长密度达80%以上的MDCK细胞，弃去生长液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤细胞瓶3_4次；
6)向各细胞瓶中分别加入Iml含胰酶的DMEM培养液，室温放置15_20min，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为25-50yg /ml；
7)取上述步骤4)冻融后的细胞培养液1-1.5mL，接种于各细胞瓶中，将细胞瓶置于350C的CO2培养箱中孵育30-35min，期间振摇1_2次，所述CO2培养箱中CO2的浓度为5%;
8)在各细胞瓶中分别加入8-10mlDMEM培养液，将细胞瓶继续置于上述CO2培养箱中继续培养5天后，收获细胞培养液，并反复冻融3次，此为盲传第2代；
9)重复上述步骤5)-步骤8)，此为盲传第3代；
10)灭活检验方法:
结果判定:上述步骤中盲传3代的各瓶细胞(接种禽流感抗原液或细胞培养液的细胞)均无细胞病变出现，则判定为禽流感抗原液灭活完全;各代细胞瓶任何I瓶出现细胞病变，则判定为禽流感抗原液灭活不完全。
[0010]所述细胞瓶为T25细胞瓶。
[0011 ]各细胞瓶中，所述胰酶在各细胞瓶培养液中的终浓度为2.5-5.0yg /ml。
[0012]所述DMEM培养液为DMEM培养基用超纯水配制而成，并调节pH至7.4。所述DMEM培养基为CIBCO公司生产。
[0013]本发明采用以上技术方案，相比于现有技术中，禽流感灭活疫苗的灭活检验方法多采用接种鸡尿囊腔接种，培养一定时间后观察鸡胚死亡情况并测血凝情况，该方法因涉及了鸡胚，鸡胚质量不佳会引起非特异性死亡，鸡胚存在外源微生物也会引起死亡或血凝现象的出现，都会使检验结果不稳定或不准确。而本发明采用MDCK传代细胞系进行禽流感灭活抗原的灭活检验，因传代细胞的稳定和均一，检验结果更稳定;另因采用无外源微生物污染的MDCK细胞，从而保证了检验结果的准确性。
【具体实施方式】
[0014]—种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法，包括以下步骤:
1)取至少3瓶细胞瓶培养MDCK细胞24-30h，MDCK细胞生长密度达80%以上时，弃去生长液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤细胞瓶3_4次；
2)向各细胞瓶中分别加入Iml含胰酶的DMEM培养液，室温放置15_20min，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为25-50yg /ml；
3)将灭活后的禽流感抗原液做10倍稀释后，各取1-1.5mL分别接种于各个细胞瓶中，将细胞瓶置于35°C的CO2培养箱中孵育30-35min，使灭活后的禽流感抗原液在MDCK细胞上吸附，期间振摇1-2次，所述CO2培养箱中CO2的浓度为5%;
4)吸附后，在各细胞瓶中分别加入8-10mlDMEM培养液，将细胞瓶继续置于上述0)2培养箱中继续培养5天后，收获细胞培养液，并反复冻融3次，此为盲传第I代；
5)取至少3瓶已生长24-30h，并且生长密度达80%以上的MDCK细胞，弃去生长液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤细胞瓶3_4次；
6)向各细胞瓶中分别加入Iml含胰酶的DMEM培养液，室温放置15_20min，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为25-50yg /ml；
7)取上述步骤4)冻融后的细胞培养液1-1.5mL，接种于各细胞瓶中，将细胞瓶置于350C的CO2培养箱中孵育30-35min，期间振摇1_2次，所述CO2培养箱中CO2的浓度为5%;
8)在各细胞瓶中分别加入8-10mlDMEM培养液，将细胞瓶继续置于上述CO2培养箱中继续培养5天后，收获细胞培养液，并反复冻融3次，此为盲传第2代；
9)重复上述步骤5)-步骤8)，此为盲传第3代；
10)灭活检验方法:
结果判定:上述步骤中盲传3代的各瓶细胞(接种禽流感抗原液或细胞培养液的细胞)均无细胞病变出现，则判定为禽流感抗原液灭活完全;各代细胞瓶任何I瓶出现细胞病变，则判定为禽流感抗原液灭活不完全。
[0015]所述DMEM培养液为DMEM培养基用超纯水配制而成，并调节pH至7.4。
[0016]各细胞瓶中，所述胰酶在各细胞瓶培养液中的终浓度为2.5-5.0yg /ml。
[0017]实施例1
一种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法，包括以下步骤:
1)取3瓶T25细胞瓶培养MDCK细胞24h，MDCK细胞生长密度达80%以上时，弃去生长液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤细胞瓶3次；
2)向各细胞瓶中分别加入Iml含胰酶的DMEM培养液(pH7.4)，室温放置15miη，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为25yg /ml；
3)将灭活后的禽流感抗原液做10倍稀释后，各取ImL分别接种于各个细胞瓶中，将细胞瓶置于35°C的CO2培养箱中孵育30min，使灭活后的禽流感抗原液在MDCK细胞上吸附，期间振摇2次，所述CO2培养箱中CO2的浓度为5%;
4)吸附后，在各细胞瓶中分别加入1mlDMEM培养液(pH7.4)，将细胞瓶继续置于上述CO2培养箱中继续培养5天后，收获细胞培养液，并反复冻融3次，此为盲传第I代；
5)取3瓶已生长24h，并且生长密度达80%以上的MDCK细胞，弃去生长液，用0.0lmol/L的pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤细胞瓶3次；
6)向各细胞瓶中分别加入Iml含胰酶的DMEM培养液(pH7.4)，室温放置15min，所述DMEM培养液中胰酶的质