一种单通道下检测bcr/abl基因融合的探针标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，特别设及一种巧光原位杂交探针的标记方法和检测 试剂盒，通过使用巧光原位杂交的手段，检测样品中的样本基因组中的BCR/A化基因融合。
【背景技术】
[0002] 慢性粒细胞白血病(CML)是起源于多能造血干细胞的恶性血液病，9和22号染色体 易位形成的BCR/ABL融合基因是确诊和疗效判断的重要依据。BCR/A化分别定位于22号染色 体及9号染色体，BCR/A化融合基因是一种抗细胞调亡的基因，其表达产物通过抗细胞调亡 作用而使细胞调控发生素乱。95%的CML病人会有此融合基因，并且，该融合基因所表达的 蛋白既是祀向治疗药物甲横酸伊马替尼的作用目标。所W，检测白血病病人外周血或骨髓 的BCR/A化融合基因显得尤为重要。
[0003] 与其它检测方法相比，巧光原位杂交(FISH)特有的准确性和直观性使其成为检测 BCR/A化融合基因的金标准。但传统的FISH试剂盒使用常规的有机巧光染料来进行探针标 记，难W克服两个弱点：
[0004] 1)有机巧光染料(如切3，FAM等)巧光强度较弱，必须W较大的基因组DNA片段为模 板标记探针，才能检测到较强的巧光信号。WBCR/A化基因检测为例，传统的FISH探针必须 分别WBCR、A化两个基因附近600kB的基因组DNA片段为模板进行标记，才能得到较为理想 的巧光信号。但由于600kB的DNA片段太大，不得不拆分成IOOkB左右的亚克隆进行保存。从 而每次探针标记都必须对10余个亚克隆进行分别标记，大大增加了 BCR/A化融合基因检测 试剂盒的生产难度，从而提高了生产成本。
[0005] 2)不同颜色的有机巧光染料，有不同的激发波长，如切3在548nm波长激发光下发 出红色巧光，FAM在492nm波长激发光下发出绿色巧光，而染细胞核的DAPI在340nm波长激发 光下发出蓝色巧光。故而FI細检测结果中，代表BCR基因的红色巧光和代表A化基因的绿色 巧光无法在同一巧光通道下出现，不能直接通过肉眼观察判断红绿巧光信号是否有重合， 良阳CR/A化基因是否有融合，只能在红/绿巧光通道下分别拍照，通过图像分析软件处理后 再加 W判断，检测效率较低。
【发明内容】
[0006] -方面，本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了量子点巧光染 料在检测BCR/A化基因融合的探针中的应用。
[0007] 优选地，所述量子点巧光染料为CdSe/ZnS和CdTe/ZnS;所述检测BCR/A化基因融合 的探针包括检测BCR基因的探针和检测A化基因的探针，更优选地，所述CdSe/ZnS和CdTe/ ZnS分别标记在检测BCR基因的探针和检测A化基因的探针上。
[000引在上述技术方案中，在检测BCR/A化基因融合的探针的标记过程中使用量子点巧 光染料CdSe/ZnS和CdTe/ZnS替代传统巧光染料，使得标记完成后的BCR探针在激发光下发 出红色巧光，巧光基团激发波长340nm，发射波长为570nm;而探针在同一波长单色激发 光下发出绿色巧光，巧光基团激发波长为340nm，发射波长为510nm。
[0009] 另一方面，本发明还提供了一种检测BCR基因的探针的标记方法，用核酸探针标记 方法对BCR基因进行探针标记，标记时使用的模板序列为人染色体22qll.21~22qll.26区， 使用的巧光染料为量子点巧光染料。
[0010] 优选地，所述量子点巧光染料为CdSe/ZnS。
[0011] 所述核酸探针标记方法可为现有技术中常用的核酸探针标记方法，优选地，所述 核酸探针标记方法为缺口平移法、随机引物法或PCR法。
[0012] 再一方面，本发明还提供了一种检测基因的探针的标记方法，用核酸探针标记 方法对基因进行探针标记，标记时使用的模板序列为人染色体9q34.62~9q34.78区，使 用的巧光染料为量子点巧光染料。
[0013] 优选地，所述量子点巧光染料C肌e/ZnS。
[0014] 所述核酸探针标记方法可为现有技术中常用的核酸探针标记方法，优选地，所述 核酸探针标记方法为缺口平移法、随机引物法或PCR法。
[0015] 又一方面，本发明还提供了一种检测BCR/A化基因融合的探针的标记方法，所述检 测BCR/A化基因融合的探针包括检测BCR基因的探针和检测A化基因的探针，用核酸探针标 记方法对分别对BCR基因和A化基因进行探针标记，检测BCR基因的探针标记时使用的模板 为人染色体22ql 1.21~22ql 1.26区，检测基因的探针标记时使用的模板为人染色体 9q34.62~9q34.78区，检测BCR基因的探针与检巧UA化基因的探针使用的巧光染料为两种不 同的量子点巧光染料，两种量子点巧光染料在同一波长的单色激发光下发出不同颜色的巧 光。
[0016] 优选地，所述检测BCR基因的探针使用的量子点巧光染料为CdSe/ZnS，所述检测 A化基因的探针使用的量子点巧光染料为CdTe/ZnS。
[0017] 所述核酸探针标记方法可为现有技术中常用的核酸探针标记方法，优选地，所述 核酸探针标记方法为缺口平移法、随机引物法或PCR法。
[0018] 本发明还提供了根据所述的检测BCR/A化基因融合的探针的标记方法制得的检测 BCR/A化基因融合的探针。
[0019] 巧光原位杂交技术进行探针标记时，为了得到较为理想的巧光信号强度，通常需 要使用非常大的基因组DNA片段作为标记的模板，如传统的FISH探针通常选用BCR、A化两个 基因附近600kB的基因组DNA片段为模板。如此之大的DNA片段无法保存到一个克隆中，只能 拆分成多个克隆进行保存和后续的探针标记，大大增加了 BCR/A化融合基因检测试剂盒的 生产难度和生产成本。由于量子点巧光染料(CdSe/化S、CdTe/ZnS)的巧光强度远远高于有 机巧光染料(切3，FAM等），所W选用较小的基因组DNA片段作为模板进行探针标记亦能得到 较为理想的效果。本发明通过大量实验，将最适的区域定位为BCR模板:人染色体22qll. 21 ~22ql 1.23区;A化模板:人染色体9q34.62~9q34.68区。两个模板区域均不超过60kB大小， 仅为常规BCR/ABL FISH检测试剂盒模板区域的1/10,大大降低的生产难度，并提高了产品 的稳定性。
[0020] 进一步地，本发明还提供了一种检测BCR/A化基因融合的试剂盒，包括所述的检测 BCR/A化基因融合的探针。
[0021 ]优选地，所述试剂盒还包括杂交液和洗涂液；
[0022] 其中，所述杂交液包含lO-lOOmmol/L化Cl、10-50mmol/L构祿酸钢、5-20%硫酸葡 聚糖、20-50%去离子甲酯胺、0.01-0.1 %琉基丙酸、0.1-1 %牛血清白蛋白W及0.1-1 %娃 鱼精DNA，杂交液的抑值为6-10;
[0023] 所述洗涂液包含lO-lOOmmol/L 化Cl、10-50mmol/L构祿酸钢、0.0 l-0.2%十二烧 基硫酸钢，洗涂液pH值为6-10。
[0024] 所述探针的浓度为1-lOnmol/L。
[0025] 更进一步地，本发明还提供了利用所述的试剂盒检测BCR/A化基因融合的方法，其 特征在于:包括W下步骤：
[0026] 1)向待测样本中加入所述杂交液和探针；
[0027] 2)将加有杂交液和探针的待测样本在90-95°C变性5~10分钟后，于40~45°C恒溫 杂交10-16小时；
[0028] 3)洗涂、封片后，通过巧光显微镜在单通道下观察显色结果。
[0029] 当所述检测BCR基因的探针使用的量子点巧光染料为CdSe/ZnS，所述检测A化基因 的探针使用的量子点巧光染料为CdTe/ZnS时，在巧光显微镜下细胞核呈蓝色巧光，BCR基因 呈红色巧光，A化基因呈绿色巧光，如BCR/A化基因发生融合，则呈黄色巧光。
[0030] 优选地，利用所述的试剂盒检测BCR/A化基因融合的方法，具体包括W下步骤：
[0031] (1)将待检样品固定在载玻片上；
[0032] (2)如待检样本为细胞，直接进入步骤(3)，如待检样本为石蜡切片，则按标准脱蜡 步骤进行脱蜡后进入步骤(3);
[0033] (3)在样品上加入10化杂交液，和化L所述的探针，浓度为1-lOnmol/L，盖上盖玻 片，并用胶密封玻片四周，W防止杂交液蒸发；
[0034] (4)将玻片放置在杂交仪中，90-95°C变性5分钟后，42°C恒溫杂交10-16小时；
[0035] (5)移去盖玻片，将载玻片放入预热到60-68°C的洗涂液中，恒溫洗涂2次，每次15 分钟；
[0036] (6)烘干玻片，滴加含1-lOmmol/L DAPI的封片剂进行封片，巧光显微镜下100倍目 镜，340皿激发通道进行观察;在巧光显微镜下细胞核呈蓝色巧光，BCR基因呈红色巧光，A化 基因呈绿色巧光，如BCR/A化基因发生融合，则呈黄色巧光。
[0037] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0038] 本发明使用量子点巧光染料对BCR和A化两个基因进行巧光标记，使其在同一波长 激发光下分别发出不同的巧光，使用FISH检测时可在一个巧光通道中观察，从而提高检测 效率。特别是利用CdSe/ZnS和CdTe/ZnS分别对BCR和A化两个基因进行巧光标记，使其在 34化m波长激发光下，分别发出红色巧光和绿色巧光，当两个基因发生融合时，红色巧光和 绿色巧光信号重叠而呈现出黄色巧光信号，大大提高了检测效率。
[0039] 本发明通过大量实验，将最适的区域定位为BCR模板：人染色体22qll.21~ 22ql 1.23区;A化模板:人染色体9q34.62~9q34.68区。两个模板区域均不超过60kB大小，仅 为常规BCR/ABL FISH检测试剂盒模板区域的1/10,大大降低的生产难度，并提高了产品的 稳定性。
【附图说明】
[0040]图I为常规有机巧光基团标记BCR/A化探针的检测结果；
[0041 ]图2为本发明量子点巧光染料标记BCR/A化探针的检测结果。
【具体实施方式】
[0042] 巧光原位杂交(^Fluorescence In Situ Hybridization,简称FI甜)的基本原理是 用标记了巧光的单链DNA(探针）和与其互补的DNA(样本）杂交，通过观察巧光信号在细胞 核，染色体上的位置和数量来反映相应基因的情况。由于其直观、快速、敏感性高和方便灵 活，在癌症，遗传，血液学的诊断中越来越得到广泛应用是多种肿瘤和血液病临床检测的金 标准。
[0043] FISH技术的特点是可W使用多色巧光对多个基因进行标记和检测，但缺点是每种 颜色的巧光都必须用在其特定的巧光通道下，用特定波长的激发光源进行激发，故而每增 加一种颜色的巧光标记，就必须在巧光显微镜下增加一种巧光通道进行观察，增加了检