高活性人细胞因子Eotaxin-2的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和食品医药技术领域，特别涉及一种高活性人细胞因子 Eotaxin-2的快速、大量制备方法及用途。
【背景技术】
[0002] 高活性细胞趋化因子Eotaxin-2属于β趋化因子或CC化学趋化因子家族的成员，是 一种分子量多为8-10kDa的一种蛋白质。以近Ν-端处有2个相邻的半胱氨酸为特征。通过与 具有7个跨膜区的G蛋白偶联受体即趋化因子受体结合，激活细胞内的信号转导通路，在细 胞的迀移中发挥了重要作用。
[0003] 目前越来越多的研究表明Eotaxin-2的趋化因子受体CCR3在炎症反应、过敏性哮 喘等疾病中发挥着关键作用，是重要的药物靶点，通过阻断CCR3的信号传导途径将有望大 大缓解或彻底治愈炎症及过敏性哮喘等相关疾病。因此，Eotaxin-2作为趋化因子的重要的 组成部分，其研究受到了广泛的关注。
[0004] 在1997年及1999年又分别发现了Eotaxin-2和Eotaxin-3,二者的基因都位于 7qll. 23,他们的生物学作用非常相似，Eotaxin-2的趋化活性与Eotaxin-Ι相似，但氨基酸 的同源序列只有39%，而Eotaxin-3与Eotaxin-Ι氨基酸的同源序列只有37 %，Eotaxin-3对 嗜酸性粒细胞的趋化活性是Eotaxin-2和Eotaxin-l的10%(李静.趋化因子eotaxin及其受 体与支气管哮喘[J].国际儿科学杂志，2006,33(3) :406-408)。
[0005] Eotaxin-2由78个氨基酸组成，其分子量为8.8X103，Eotaxin-2的结构包括一个 螺旋，随后是3个反向平行的β片层和一个α螺旋。N-loop通过两个保守的二硫键将N-末端/ N-loop区域与β片层连接在一起。与CCR3的N-末端区域相对的线性肽与Eotaxin-2结合，诱 导许多氨基酸残基浓度依赖的化学位移改变或线性增加。这些氨基酸残基的移动表明肽与 N-loop和β2_β3发卡结构之间的表面的扩展槽结合。受体肽也可能与趋化因子的N-端和α螺 旋的部分相互作用。Eo tax in-2的结构与趋化因子结构的不同之处，可能对其与受体结合的 特异性相关（Mayer K.L.，Stone M.J. .NMR solution structure and receptor peptide binding of the CC chemokine eotaxin-2[J].Biochemistry,2000,V39(29):8382-8395)。
[0006] 目前Eotaxin-2的获得由两种主要途径:从活体中天然提取和用基因工程的方法 进行基因克隆到原核细胞中进行异源表达。第一种方法产量低，成本过高，不利于大规模生 产，第二种方法经常会产生过量表达，然而过量表达会产生不溶和无活性的多肽，不溶的聚 集物通常形成包涵体(刘华，李敏.基因重组蛋白的表达系统与分离纯化研究进展[J].福建 师范大学报，2007,23(1): 100-104;Proudfoot A.E.I.，Borlat F. .Chemokine Protocols [M].Humana Press,New York,2002,7587)。
[0007] 重组蛋白被包裹在包涵体中是不具有生物活性的，必须重新增溶、变性和复性以 促进分子内正确二硫键和自然构象的形成，这个过程由于增加了许多色谱分离纯化步骤而 比较费时且复性效果不好。因此，需要建立一个更加快速、高效的趋化因子表达系统，不仅 可溶性蛋白表达量高，而且分离纯化步骤简单。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题在于:提供了一种简便、快速、低成本、高产量、高纯度 的细胞趋化因子Eotaxin-2的制备方法，并对其活性进行了验证。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性细胞因子的制备方法，包括如下 步骤：
[0010]步骤1:根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工 合成目的基因；
[0011] 步骤2:通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C 端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III;
[0012] 步骤3:利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同 酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-2蛋白。
[0013] 所述步骤1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA。
[0014] 所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：
[0015] EcoR I site 6XHis TEV cleavage site Hindlllsite
[0016] 5-tatagtgaattc|G\GG\ 丁 GATGAGGAGGX^gaaaacctgtattttcagggt- Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
[0017]所述高活性细胞因子的制备方法，可以进一步包括：
[0018] 步骤4:将诱导表达后的大肠杆菌收集、高压破碎、离心、过滤、镍柱亲和层析、凝胶 过滤脱盐、酶切除去His标签后得到纯度很高的蛋白。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据 NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
[0020] 所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA〇
[0021] 为解决上述技术问题，本发明另提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据 NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；并通 过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性 酶切位点EcoR I和Hind III;
[0022] 所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
[0023] EcoR I site 6XHis TEV cleavage site Hindlllsite
[0024] S-TATAGTGAATTcICACCATCATCACCACCAliGAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
[0025] 为解决上述技术问题，本发明又提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的 制备方法在制备治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、过敏性疾病、寄 生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
[0026] 为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如前述任一项所述人工合成基因在制 备治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、过敏性疾病、寄生虫感染、系 统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
[0027] 为解决上述技术问题，本发明另提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的 制备方法和/或所述人工合成基因，在治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病 (HIV)、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物设计方面 的应用。
[0028] 所述的表达载体为普通大肠杆菌表达载体，优选质粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X， 分别对应于大肠杆菌宿主菌BL21 (DE3)、0rigami、TB1。
[0029] 本发明还进一步对所用表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行了优化，最终优 化的表达条件为:表达载体选用pET28a、0D 6(x) = 1.0~1.2、诱导时间为8h、诱导温度为25°C。
[0030] 本发明方法还可以用SDS-PAGE、质谱方法对制备得到的蛋白的纯度和分子量进行 了分析和验证，用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的Eotaxin-2的生物活性进行了表 征。
[0031 ]本发明制备得到的Eotaxin-2纯度很高且有生物活性，在相关疾病的治疗和药物 的设计方面显示了很大的应用前景。
[0032]本发明有益的技术效果在于：
[0033] 1.本发明为运用基因工程技术，将Eotaxin-2基因进行了优化，并在其N端加入了 能与Ni柱特异性结合的His标签以及后续可以去除标签的TEV酶切位点，在N端和C端分别加 入限制性酶切位点EcoR I和Hind III，连接到表达载体上然后转入相应的大肠杆菌表达体 系中，在菌体〇D6Q()= 1.0~1.2时加入IPTG诱导蛋白表达。这一生产过程生产周期为12个小 时，同时大肠杆菌易于实现高密度大规模培养，从而大大缩短了培养时间，降低生产成本。 [0034] 2.大肠杆菌细胞容易破碎，且含杂蛋白比较少，因为是诱导型表达，有利于目的蛋 白的富集和反应过程的调控，使得下游纯化过程变得更加简单，容易获得低成本、高产量、 高纯度的Eotaxin-2蛋白。
[0035] 3、本发明通过优化最终选择表达菌株pET28a/BL21(DE3)，使Eotaxin-2水溶性表 达量高，包涵体形成较少，所得蛋白结构折叠正确，具有生物活性。培养1L大肠杆菌可以获 得3.87mg左右的蛋白，和传统提取方法相比产量提高很多倍。
[0036] 4、本发明Eotaxin-2的分离纯化过程简单，只经过镍柱亲和层析和凝胶层析两步， 减少了过多的分离纯化步骤对蛋白活性和产量的影响。
[0037] 5、在蛋白的纯化过程中杂蛋白组氨基酸的含量比较少，在与目的蛋白进行竞争性 结合Ni柱时，由于结合力较弱非常容易就被少量的咪唑洗脱下来，而目的蛋白用500mM的咪 唑洗脱，从而得到纯度很高的蛋白。
[0038] 6、本发明中通过Eotaxin-2表达体系的选择、表达条件的优化和表达过程的调控， 进一步提高了蛋白的产量，并且获得的蛋白中单体比较多，二聚体和寡聚体很少。
[0039] 7、本发明用表面等离子共振技术（SPR)对制备得到的Eotaxin-2的生物活性进行 了验证，通过活性实验可以看出本实验室制备的Eotaxin-2比商业化的Eotaxin-2与CCR3的 结合亲和力高10倍左右，因此在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了更大的应用前 景。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明细胞因子Eotaxin-2表达载体PET28a-Eotaxin-2基因的构建图。<