一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域的治疗用血液制品，特别是涉及一种巨细胞人免疫球蛋 白及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 人巨细胞病毒(Human cylomegalovirus，HCMV)，也称人痕疼病毒5型(HHV5)，属β 疱疹病毒亚科。HCMV是人类先天性病毒感染的最常见病原之一，该病毒在我国成人感染率 高达95%以上。普通人通常为隐性感染，但对于免疫力低下人群，如骨髓和实体器官移植受 者、HIV感染者和肿瘤患者，HCMV感染会导致严重后果。孕妇原发或复发HCMV感染引起新生 儿宫内感染或围产期感染侵袭胎儿，可致感染患儿中枢神经系统受累、多器官损害、智力低 下或耳聋等;在正常健康人中可引起单核细胞增多症;在免疫缺陷者如器官移植受者、获得 性免疫缺陷综合症者及癌症患者中可引起严重的感染，甚至死亡。国外临床上广泛使用抗 病毒药物联合巨细胞病毒特异性人免疫球蛋白（CMV-IVIG)防治实体器官移植患者术后 HCMV感染及相关疾病。但目前国内尚无 CMV-IVIG上市，因此，开发高效价的HCMV特异性中和 抗体的人免疫球蛋白制品具有重要意义。
[0003] 但是由于巨细胞人免疫球蛋白对于原料选择以及制备条件的要求比较苛刻，所以 目前的巨细胞人免疫球蛋白普遍存在效率低、性质不稳定等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种有效治疗巨细胞病毒重症感染的人免疫球 蛋白及其制备方法，使其应用于工业化生产，且产品高效、安全、可靠。
[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006] 本发明提供一种静注巨细胞人免疫球蛋白，巨细胞人免疫球蛋白中和抗体效价大 于等于1:500。
[0007] 所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。免疫球蛋白纯 度与总蛋白的质量百分比在98.5%_100%之间。
[0008] 在制备时，其原料血浆为巨细胞病毒抗体效价不低于1:20的血浆。
[0009] 所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99%_99.5%，PKA(中文含义为激肽释 放酶原激活剂H 30IU/mL，ACA(中文含义为抗补体活性Η 45%。
[0010] 本发明所述静注巨细胞人免疫球蛋白可以有效治疗巨细胞病毒重症感染，具有高 效、安全和可靠等优点，适合大规模的工业化生产。
[0011] 为方便使用以及长久的保持其有效，本发明所述静注巨细胞人免疫球蛋白的剂型 为液体制剂或冻干制剂。
[0012] 本发明提供一种静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0013] (1)用中和试验法筛选出巨细胞病毒不低于1:20中和抗体效价滴度的原料血浆；
[0014] (2)以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆中巨细胞病毒 中和抗体效价滴度不低于1:160;
[0015] (3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合阴离子交换层析法纯化 生产人免疫球蛋白，生产操作压力为〇. 05-0.3MPa，包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从 组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到产品。
[0016] 进一步，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括：
[0017] (A)样品稀释：
[0018] 血浆样本用细胞维持液预先进行1:4预稀释后，56°C灭活30分钟，之后继续5倍稀 释，即最终1:20倍稀释样品液；
[0019] 打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板 盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次；
[0020] 将预先灭活的1:20倍稀释样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品 50yL，病毒回滴孔与阴性对照孔分别加50yL细胞维持液，每样品作竖向两孔平行;所述细胞 维持液为体积比为5 %的胎牛血清的MEM液；
[0021] (B)攻击病毒：
[0022] 攻击病毒液制备:根据试验的标本数用细胞维持液制备足量的攻击病毒液，将病 毒稀释到100CCID5Q/0.05mL;除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50yL含 100CCID5Q的攻击病毒液；
[0023]回滴100CCID5Q攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作ΠΓ^ΠΓ^ΠΓ3稀释，将 攻击病毒液10*3与其10 \ 10 2、10 3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔 中，每个稀释度加10孔，5〇yL/孔；
[0024]阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50yL细胞维持液;将所有96孔细胞板放入37 °C、含有C〇2体积百分数为5 %的培养箱中和培养2小时；
[0025] (C)细胞悬液的配制与添加：
[0026]细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液 量，试验用细胞悬液浓度应为1 X 1〇5个/mL，配好的细胞液立即使用；
[0027]细胞悬加:将步骤(B)中和培养后的每孔加细胞悬液1 OOyL，约1 X 104个/孔；
[0028] (D)培养及观察统计：
[0029]将完成以上操作的96孔细胞板放置37°C、含有C02体积百分数为5%的培养箱中培 养11天，病毒接种后的第9天显微镜下观察细胞生长情况，第11天最终判定结果，并记录统 计。
[0030] 进一步，步骤(3)生产人免疫球蛋白的具体步骤包括：
[0031] (A)从血浆中分离组分II+III:将冷冻血浆在温度在2-4 °C之间融化，离心去冷沉 淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.0-7.2，加入体积分数为54 %的乙醇溶液， 使血衆中乙醇的最终浓度为8%-10%，使反应液的最终温度为-2至-4°C，离心分离组分I， 用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.9-6.0，加入体积分数为95 %的乙醇 溶液，使血浆中乙醇的浓度达到20 %，使反应液的最终温度控制在-2.0 °C至-5.0 °C，用压滤 机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打 开压滤机，收取组分II+III沉淀；
[0032] (B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4-8倍质量预冷的注射用水溶解， 使反应温度控制在0至4.0°C。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05-5.25，加 入体积分数为95 %的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18 %，反应液温度最终控制在-3.5°C至-6.5°C，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；向组分III上清液中加入1M碳 酸氢钠溶液调节pH值为7.1-7.5，按每升溶液添加2.8g氯化钠的比例补加氯化钠以提高反 应液离子强度;加入体积分数为95 %的乙醇溶液，使反应液中乙醇的最终浓度为25 %，在加 入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9.0°C至-12.0°C，继续搅拌0.5小时，静止1小 时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压 滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制 品；
[0033] (C)加入6-8倍质量的组分II沉淀量的注射用水溶解后，澄清过滤、超滤脱盐，控制 蛋白液电导率不高于〇.35ms/cm，按每升蛋白液加入80-120g甘氨酸的比例加入甘氨酸作为 保护剂，用〇. 1-0.5mol/L碳酸氢钠溶液调整蛋白液pH至7 ± 0.2，在60.0 ± 0.5 °C条件下巴氏 灭活10小时；
[0034] (D)巴氏灭活结束后，降温制品至25°C以下，用0 . lmol/L盐酸溶液调整制品pH为 6.8-7.2，降温蛋白液至2 °C以下，搅拌加入-15 °C以下的体积分数为95 %的乙醇溶液，使制 品中乙醇浓度为18%-22%，控制最终温度在-1至6°C，搅拌反应1小时以上，按0.5-2g/L蛋 白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6 °C以下，压力 控制在0-0.3Mpa，沉淀废弃，之后，用0. lmol/L氢氧化钠溶液或0. lmol/L盐酸溶液调整滤出 液pH为6.9-7.3，搅拌加入-15°C以下的体积分数为95%乙醇的乙醇溶液，使制品中乙醇终 浓度为20%-24%，控制最终温度在-6至-12°C，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀，滤过液 温度控制在_3°C以下，压力控制在0-0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀称 重；
[0035] (E)将步骤(D)加压后的沉淀用0_4°C注射用水溶解6-8小时，溶解温度控制在0°〇 3.0°C ;将充分溶解的组分II过滤澄清，加入3%盐酸调节溶液的pH值至6.40-6.80之间，用 5 %氯化钠溶液调节溶液的电导为1.30-1.50ms/m;采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交 联葡聚糖凝胶装填层析柱；用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为 6.40-6.80的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.40-6.80后上样，上样压力不超过 1.5kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.40-6.80的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶 上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3 %盐酸调节溶液pH至3.60-3.90，将调整好的 蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；
[0036] (F)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在3 °C -9.0 °C之间，蛋白浓度达到6 % -8 % (g/mL)时，加入3.0 °C -9.0 °C注射用水，使液蛋白浓度在2 % -6 %并进行恒体积超滤透析脱 盐，超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析过程中注意补加3%HC1适量以保持蛋白液 pH在3.50-4.00;透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8%以上，用3.0°C-9.0