呋喃妥因半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种半抗原、抗原及其制备方法，具体涉及一种呋喃妥因半抗原和抗 原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 硝基呋喃类物质（Nitrofurans)是一类人工合成的具有5-硝基呋喃环基本结构 的广谱抗菌药物，主要包括呋喃西林（Nitrofurazone)、呋喃妥因（附1^〇;1!\1抑111:;[011)、呋喃 唑酮（Furazolidone)和呋喃它酮（Furaltadone)。硝基呋喃类物质对大多数革兰氏阳性 菌、革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，在畜禽养殖、水产养殖上应用非常 广泛。但硝基呋喃类物质对畜禽有一定的毒性，动物大剂量或长期连续服用硝基呋喃类物 质易引起中毒性反应，表现为厌食、腹泻、胃肠出血、周围神经炎、兴奋、惊厥或瘫痪等，中毒 严重时甚至可以引起动物死亡。同时硝基呋喃类物质也是一类具有潜在致癌性和诱导有机 体产生突变的物质。1990年7月欧盟颁布2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类物质及其代谢 物列为A类禁用药物，规定其在动物源性食品中的残留检测限为1. 0 μ g/kg。由于对呋喃唑 酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，自1995年起，欧盟全面规定禁止使用呋喃类抗菌 物质，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。欧盟从1997年开始将所有的 硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中 使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部文件农牧发[2002] 1号 也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出。目前，国内外都对呋喃类物质的控 制相当严格，各国对于呋喃类物质测定的标准都有明确的规定。
[0003] 由于呋喃妥因在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长 的一段时间，所以在分析此类药物的残留时要经常分析其代谢后的产物，检测监管部门就 以检测代谢产物为手段达到检测呋喃妥因残留的目的。
[0004] 呋喃妥因的检测方法分为物理化学法和免疫化学法，前者有液相色谱法（LC)、高 效液相色谱法（HPLC)、质谱法（MS)等，后者主要是酶免法（ELISA)，检测的灵敏度均达到 ppb(y g/kg)级别。近几年，国内外学者又研发出液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS)、液相色 谱电喷雾电离质谱法（LC-EITMS)、微生物分析等物理检测新方法，对ELISA方法的应用也 有了进一步研究。
[0005] 化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程 度高、试剂稳定且有效期长（6~18个月）等优点，其检测限比ELISA和理化检测方法高几个 数量级。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种呋喃妥因半抗原及其制备方法和在化学发光试剂盒中 的应用。
[0007] 本发明提供的呋喃妥因半抗原，为式1所示的化合物；
[0008] 本发明还公开了式1所示化合物的制备方法，包括如下步骤： ① 10ml单口瓶中投入呋喃妥因代谢物AHD 115mg，吡啶2ml，搅拌5min ; ② 全溶解后降温至0度，加入间羧基苯磺酰氯250mg，0度搅拌lh，恢复至室温反应过 夜； ③ TLC检测AHD反应完全后，将反应液加入15ml冰水中，搅拌30min，过滤，水洗滤饼， 干燥得260 mg AHD半抗原。
[0009] 本发明提供的AHD抗原，是将式1所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。
[0010] 常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲状腺蛋白（TG)或血蓝蛋白（KLH)等。
[0011] 所述式1所示化合物与BSA偶联得到的AHD抗原的结构示意图见图1。
[0012] 本发明还公开了所述AHD抗原的制备方法，包括如下步骤： ① 取上述半抗原115. 7mg溶于10. 7mlDMF中，搅拌使之充分溶解。加入EDC 221. 75mg 和NHS 191.4mg，室温反应3h; ② 称取144. lmg BSA溶于15ml 0. 1M碳酸缓冲溶液（pH=9. 6)中，搅拌lOmin，充分溶 解； ③ 将步骤1的活化液3. 6ml，在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中，边加边搅拌，室 温磁力搅拌（400rpm)反应24h ; ④ 将反应产物装入一个蒸馏水冲洗干净的透析袋（15cm)，1L PB (1 X，pH7. 2)室温搅 拌（lOOrpm)透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物4500rpm离 心6min，0. 5ml/管分装，将抗原编号，-20°C保存备用； 所述呋喃妥因代谢物抗原可以作为免疫原制备呋喃妥因代谢物特异性抗体，也可以作 为包被原制备化学发光微孔板。
[0013] 应用呋喃妥因代谢物抗原制备得到的特异性抗体具体可为单克隆抗体或多克隆 抗体。
[0014] 所述呋喃妥因代谢物抗原、所述特异性抗体均可应用于检测呋喃妥因代谢物。
[0015] 本发明还公开了应用呋喃妥因代谢物抗原和呋喃妥因代谢物特异性抗体制备得 到的化学发光酶联免疫试剂盒。
[0016] 所述化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括：包被有呋喃妥因代谢物代谢物抗原的 化学发光微孔板、酶标抗体工作液、呋喃妥因代谢物代谢物标准溶液、发光底物液、浓缩复 溶液、浓缩洗涤液。
[0017] 本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目 标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物 的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分 析物。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术 中对呋喃妥因代谢物样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中 要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的呋喃妥因代谢物抗原，通 过免疫动物可产生了针对呋喃妥因代谢物的特异性抗体，用于快速检测食品中的呋喃妥因 代谢物残留，具有操作简单、快速，处理样品量大，灵敏度高，特异性强等诸多优点。
【附图说明】
[0018] 图1为呋喃妥因代谢物抗原的结构示意图。
[0019] 图2为呋喃妥因代谢物化学发光酶联免疫检测试剂盒标准曲线。
【具体实施方式】
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0021] 实施例1、呋喃妥因代谢物半抗原的制备 呋喃妥因代谢物半抗原的制备方法，具体操作步骤包括： ① 10ml单口瓶中投入呋喃妥因代谢物AHD115mg，吡啶2ml，搅拌5min ; ② 全溶解后降温至0度，加入间羧基苯磺酰氯250mg，0度搅拌lh，恢复至室温反应过 夜； ③ TLC检测AHD反应完全后，将反应液加入15ml冰水中，搅拌30min，过滤，水洗滤饼， 干燥得260 mg AHD半抗原。
[0022] 半抗原的结构式见式1 :
[0023] 实施例2、呋喃妥因代谢物人工抗原的制备 一、呋喃妥因代谢物免疫抗原的合成 ① 取上述半抗原115. 7mg溶于10. 7mlDMF中，搅拌使之充分溶解。加入EDC 221. 75mg 和NHS 191.4mg，室温反应3h; ② 称取144. lmg BSA溶于15ml 0. 1M碳酸缓冲溶液（pH=9. 6)中，搅拌lOmin，充分溶 解； ③ 将步骤1的活化液3. 6ml，在冰水浴环境下逐滴加入到蛋白溶液中，边加边搅拌，室 温磁力搅拌（400rpm)反应24h ; ④ 将反应产物装入一个蒸馏水冲洗干净的透析袋（15cm)，1L PB (1 X，pH7. 2)室温搅 拌（lOOrpm)透析3d，每天换液3次(早中晚各一次)，共计换液9次，将透析产物4500rpm离 心6min，0. 5ml/管分装，将抗原编号，-20°C保存备用。
[0024] 免疫原的结构式见图1。
[0025] 二、呋喃妥因代谢物包被抗原的合成 ①取上述半抗原115. 7mg溶于10. 7mlDMF中，搅拌使之充分溶解。加入EDC 221. 75mg 和NHS 191.4mg，室温反应3h。
[0026] ②称取96. 8mg BSA溶于15ml 0. 1M碳酸缓冲溶液（pH=9. 6)中，搅拌lOmin，充