检测hla-b*51等位基因的方法和引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测HLA-B*51等位基因的引物和 方法。
【背景技术】
[0002] 白塞病（adamantiades-behcet' s disease ABD)又称贝赫切特病、口-眼-生殖 器三联征等。是一种慢性全身性血管炎症性疾病，主要表现为复发性口腔溃疡、生殖器溃 疡、眼炎及皮肤损害，也可累及血管、神经系统、消化道、关节、肺、肾、附睾等器官。其发病范 围位于北炜30°~45°的欧亚地区，东起东亚如日本、朝鲜、中国，向西延伸至中亚如土耳 其、伊朗直到地中海沿岸，与古代丝绸之路基本吻合，又称丝绸之路病。白塞病的好发年龄 在16~40岁，大部分患者预后良好，眼、中枢神经系统及大血管受累者预后欠佳。尽管确 切的病因仍不清楚，但认为遗传及免疫是其主要的内在因素，有研究表明超过60%的白塞 病病人与HLA-B51有关。
[0003] 早于1973年Ohnos就发现HLA-B5在ABD患者中比正常对照组出现的频率明显增 高，1978年进一步证实为HLA-B51。通过大量样本统计研究证实，45%~60%的白塞病发病 与HLA-B51呈高度正相关，但不确定是HLA-B51本身还是某个与其紧密连锁的基因造成白 塞病的易感性。为了对ABD进行候选基因的研究，评估HLA-51在ABD中的分配，一个国际研 究小组针对此进行了全基因组关联分析研究（GWAS)，研究包括了 1215例ABD病人和1278 例对照者，结果表明：HLA-B51基因型在病例组的发生率为59. 1%，对照组仅为29. 3%。在 HLA-B区段中最显著的SNP(单核苷酸基因多态性）位于从HLA-B端粒到编码MHC I类链相 关基因 A(MICA)的着丝点区域，HLA-B51和位于从HLA-B到超过着丝粒62kb的MICA基因 区域的多态基因位点之间存在强烈的连锁不平衡。HLA-B51比其他基因的SNP与疾病更为 相关。大量研究证实，不同人种和该病明显相关的只有HLA-B51，但是HLA-B51不是唯一的 致病因素，因为仍有约1/3的患者无此基因。随着对ABD发病机制研究的深入，3 了解局部 及系统免疫细胞的激活机制，了解不同临床亚型的发病机制，将有助于我们研制开发更为 特异和更少毒性的免疫抑制剂。
[0004] 目前常用的HLA等位基因分型的方法有PCR-SSO, PCR-SSP，PCR-SBT等，可分为低 分辨和高分辨方法。但这些方法不能对HLA-B*51等位基因是否为阳性做出精准的判断。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是检测患者是否HLA_B*51等位基因阳性，以辅助诊断白塞病，判断 预后，并采用更直观有效的Sanger测序法。
[0006] 本发明的目的在于提供用于检测HLA_B*51等位基因的引物，包括：扩增覆盖检 测HLA-B*51等位基因的正、反向引物HLA-B*51-F和HLA-B*51-R，以及测序引物M13-F和 M13-R ;所述引物碱基序列为：
[0007] HLA-B*51-F ： TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG
[0008] HLA-B*51-R :AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA
[0009] M13-F ：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0010] M13-R :AACAGCTATGACCATG。
[0011] 进一步地，还包括检测内参基因的引物actin-F和actin-R，所述检测内参基因的 喊基序列为：
[0012] actin-F ：CTAACTGCGCGTGCGTTCT
[0013] actin-R ：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG
[0014] 进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：HLA-B*51-F:HLA-B*51-R = 1:1。
[0015] 进一步地，所述内参基因的引物的使用浓度比为：actin-F:actin_R = 1:1。
[0016] 本发明的另一个目的在于提供一种检测检测HLA_B*51等位基因的方法，其包括 如下步骤：
[0017] (1)提取样本 DNA ;
[0018] (2)利用扩增引物 HLA-B*51-F 与 HLA-B*51-R，actin-F 与 actin-R对（1)中的 DNA 进行扩增，当两对引物的扩增都有结果，需对样本进行测序检测；
[0019] (3)利用测序引物M13-F与M13-R对⑵中HLA-B*51-F与HLA-B*51-R所得的扩 增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
[0020] (4)将⑶中的基因序列与野生型HLA_B*51等位基因序列进行比较，确定基 因序列是否完全相符；当比较结果与HLA-B*51等位基因序列完全相符，则可确定样本 HLA-B*51等位基因阳性；当只有actin-F与actin-R这对引物扩增有结果，HLA-B*51-F与 HLA-B*51-R的扩增无结果，则可确定样本HLA-B*51等位基因阴性；
[0021] 其中所述引物碱基序列为：
[0022] HLA-B*51-F ： TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG
[0023] HLA-B*51-R :AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA
[0024] actin-F ：CTAACTGCGCGTGCGTTCT
[0025] actin - R ：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG
[0026] M13-F ： TGTAAAACGACGGCCAGT
[0027] M13-R :AACAGCTATGACCATG。
[0028] 本发明的目的还在于提供一种检测HLA_B*51等位基因的试剂盒，所述试剂盒 包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、 阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括1对扩增引物HLA-B*51-F与 HLA-B*51-R，1对内参引物actin-F与actin-R，测序体系包括1对测序引物M13-F与M13-R， 包括：
[0029] HLA-B*51-F : TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG
[0030] HLA-B*5I-R:AACAGCTATGACCATGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGA
[0031] actin-F ：CTAACTGCGCGTGCGTTCT
[0032] actin - R ：AGTCCTTAGGCCGCCAGGGG
[0033] Ml3-F :TGTAAAACGACGGCCAGT
[0034] M13-R :AACAGCTATGACCATG。
[0035] 进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2 XPCR Buffer ;dNTPs ;K0D FX DNA Polymerase0
[0036] 进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和 Bigdye Terminator V3. 1〇
[0037] 进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0038] 有益效果：利用本发明所述扩增引物和内参引物，当两对引物的扩增都有结果，该 患者可能是HLA-B*51，HLA-B*5801、*5701等基因型，需测序检测，测序结果与HLA-B*51等 位基因序列完全相符，则可确定样本HLA-B*51等位基因阳性。当只有actin-F与actin-R 这对引物扩增有结果，HLA-B*51-F与HLA-B*51-R的扩增无结果，则可直接判定样本 HLA-B*51等位基因阴性。
[0039] 由于HLA-B基因属于经典HLA I类基因，目前发现的HLA-B等位基因已超过500 个。HLA-B等位基因的多态性主要表现在第2、3和4外显子，其序列可分为高度多态性位 点和相对保守位点。检测HLA-B*51基因型的扩增引物就设计在HLA-B*51等位基因高度 多态性位点的第2和第3号外显子区域，以降低测序时套峰出现的可能性，降低了结果判 读的难度。由于HLA-B*51只是HLA-B*5众多亚型中的一种，比对各个亚型的基因序列可 以发现（比如文献报道中比较常见的HLA-B*5201、HLA-B*5401、HLA-B*5601、HLA-B*5701、 HLA-B*5801等亚型），各亚型间的基因序列差异并不明显，扩增引物虽然设计在有高度多 态性位点区域，扩增引物还是会非特异性扩增出HLA-B*5801，HLA-B*5701等亚型，例如比 对各亚型的第2号和第3号外显子基因序列发现，扩增引物还是会非特异性扩增出其他 亚型，当患者体内同时具备其中两种或多种亚型时，测序时还会有套峰出现的可能性。因 此采用Sanger测序进行最终的分型。但是如果直接用HLA-B*51的扩增引物进行测序 (HLA-B*51-F与HLA-B*51-R)，由于测序本身的技术限制前几十bp会读不准，套峰的出现 将更加大了读取的难度，前面的序列如果读取不准确将会影响后面几十bp序列的读取结 果。本发明创新性的在PCR扩增的上游引物5'端和下游引物5'端分别加了一段长ISbp的 M13-F引物序列和长16bp的M13-R引物序列。这样扩增产物两端都会带上所引入的M13-F 及M13-R引物序列，随后用M13-F和M13-R直接用M13-F和M13-R引物进行正反向测序。由 于扩增产物两端带上了 M13-F及M13-R引物序列，测序结果的前期读取不会受到套峰的影 响，也使HLA-B*51基因序列的测序结果读取会更早的进入读取准确的阶段。
[0040] 本发明采用Sanger测序法检测HLA-B*51等位基因序列，通过测序结果的分析， 以确定患者是否是HLA-B*51等位基因阳性，节省了检测时间，结果容易判读，很大程度的 节省了检测成本。具有很高的特异性、准确性、灵敏度、操作简单，并且当HLA-B*51-F与 HLA-B*51-R没有扩增结果时，还可以有效排除样本本身的原因。
【附图说明】
[0041 ] 图1样品1的检测结果图。
[0042] 图2样品2的检测结果图。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编 的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0044] 实施例1
[0045] 检测HLA-B*51等位基因的引物，包括：扩增覆盖检测HLA-B*51等位基因的 正、反向引物（HLA-B*51-F和HLA-B*51-R)和扩增内参基因的正、反向引物（actin-F和 actin-R);所述扩增引物的碱基序列分别为：
[0046] HLA-B*51-F ： TGTAAAACGACGGCCAGT GGAGCCCCGCTTCATTG
[0047] HLA-B