一种鉴别红豆杉种的dna条形码引物对、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学技术领域，是利用短的DNA片段对物种进行识别和鉴定，即DNA 条形码（DNA barcoding)技术，具体涉及一种鉴别红豆杉种的DNA条形码引物对、试剂盒及 方法。
【背景技术】
[0002] DNA条形码技术是当前国际生物多样性研究的热点，即通过使用短的标准DNA片 段，对物种进行快速、准确的识别和鉴定。生物条形码联盟（Consortium for the Barcode of Life，CB0L)阐述了 DNA条形码的优点：（1)不受个体形态特征限制；（2)不受个体发育 阶段影响；（3)对于分类学中难以区分的类群，采用DNA条形码可以抛开形态相似的假象， 从基因水平上提供分类依据；(4)核苷酸序列组成的数据库可以提供明确的信息，不仅弥 补了形态描述的不足，而且可以加快已知物种的识别速度，同时便于新物种的发现，将会 使分类学科的发展更加快速和深入；（5)如果设想的条形码扫描仪可以实现，将会减少对 传统分类学人力和物力的需求。
[0003] DNA条形码技术发明以来，已在动物研究中得到广泛的应用，所采用的标准片段是 线粒体COI基因中约650bp的序列片段。然而在植物中，DNA条形码的研究进展相对缓慢， 这是因为植物基因组很难找到像动物中COI -样的通用单个片段基因，即便找到"完美"的 植物条形码，靠单亲遗传的一个片段来区分杂交种或存在基因渗透的类群也会存在诸多问 题。多数研究结果也显示，采用单片段的识别率很低，不能达到条形码的要求，因此筛选 植物条形码不能仅关注单个片段，必要时应增加片段。植物中线粒体基因组进化速率较 慢，因此条形码片段主要在叶绿体基因组上进行选择，被提议的编码基因片段主要有rpoB、 rpoCl、matK、rbcL、UPA，非编码区片段有 trnH-psbA、atpF-atpH、psbK-psbl，此外还有核基 因 ITS片段。目前，植物DNA条形码尚处于对所提议的各片段比较和评价阶段，主要有5种 组合方案被提出，但还未获得一致的标准片段。国内外研究认为，理想的DNA条形码应符 合以下几个标准：（1)单一位点就能有效鉴别不同物种；(2)在种间有明显的遗传变异和分 化，同时种内变异足够小；（3)片段足够短，便于一个反应完成测序工作，且便于DNA提取 和PCR扩增；(4)存在保守区域，便于设计通用引物。从生物多样性观点来看，仅靠几个保 守的基因片段来识别和鉴别种类繁多的植物物种目前确实面临不小的挑战。但针对物种数 量有限的某一科或属，DNA条形码是准确区分不同植物种的利器，在物种识别和保护中应用 潜力巨大。
[0004] 传统植物分类是以植物外部器官的形态特征作为依据，对其进行分类和命名。红 豆杉属物种外部形态相近，同时，由于环境因素的影响，不同物种的分辩经常会存在很大困 难，非常有必要寻找新的、有效的鉴别条形码和方法。就红豆杉在我国的分布种而言，虽然 不同的分类系统所认可的种间关系有所不同，但中国红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉和南 方红豆杉种（变种）的地位得到了不同分类系统的共识，也得到了分子数据的支持。Liu 等利用植物DNA通用条形码（rbcL、matK、trnH-psbA、trnL_F和ITS)对红豆杉属物种进行 鉴别，trnL-F和ITS单个基因片段和其它三个条形码相互组合能鉴别红豆杉属多个物种， 但这些位点的基因片段长度均较长，超过了 700bp。对单一位点TrnL-F和ITS来说，它们 在鉴别南方红豆杉时，种内存在丰富的遗传变异，并不能将同一物种完全聚为一类，也就是 说，这两个位点还没有达到完全鉴别南方红豆杉种的目的。目前，这些条形码和序列都以论 文形式公开发表，未申请专利保护。
[0005] 鉴于红豆杉属物种表型鉴别的困难和资源保护的需求，积极探寻更为理想、有效 的DNA条形码和鉴别技术，对红豆杉的保护和研究都具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴别红豆杉种的DNA条形码引物对、 试剂盒及方法。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0008] 所述鉴别红豆杉种的DNA条形码引物对为：
[0009] 上游引物 Taxus Indel-F :TCC CAG AAT ACT CCT TAT (SEQ ID NO. 1);
[0010] 下游引物Taxus Indel-R :GTT CTG GCT TCC TCT AGC ATT TCA T (SEQ ID NO. 2)。
[0011] 所述鉴别红豆杉种的DNA条形码试剂盒中含有上述DNA条形码引物对。
[0012] 其中，所述的红豆杉种包括中国红豆杉、南方红豆杉、东北红豆杉和欧洲红豆杉。 所述DNA条形码包括中国红豆杉DNA条形码、南方红豆杉DNA条形码、东北红豆杉DNA条形 码和欧洲红豆杉DNA条形码；中国红豆杉DNA条形码序列如SEQ ID NO. 3至SEQ ID NO. 6 所示，南方红豆杉DNA条形码序列如SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 8所示，东北红豆杉DNA条 形码序列如SEQ ID NO. 9所示，欧洲红豆杉DNA条形码序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0013] 所述鉴别红豆杉种的方法包括如下步骤：
[0014] (1)提取待测物种的DNA ;
[0015] (2)用上述引物对对待测物种的DNA进行PCR扩增；
[0016] (3)对PCR产物进行测序后，将PCR产物与上述的DNA条形码进行比对来鉴别红豆 杉物种。
[0017] 下面对本发明作进一步说明：
[0018] 本发明针对红豆杉种有效鉴别的现实需求，同时考虑DNA条形码理想位点的要 求，主要
【发明内容】
包括：
[0019] (I)DNA 条形码（Taxus-indel)的序列特征
[0020] 所发明的DNA条形码源于红豆杉核基因组，是一段长度为212-215bp的单一短序 列位点。利用该条形码可对红豆杉属的4主要种，中国红豆杉、南方红豆杉、东北红豆杉和 欧洲红豆杉进行有效鉴别。
[0021] (2) DNA条形码的引物序列
[0022] 所发明的DNA条形码分上游引物Taxus Indel-F和下游引物Taxus Indel-R。引 物序列分别为：
[0023] Taxus Indel-I-F :TCC CAG AAT ACT CCT TAT(SEQ ID NO. 1)
[0024] Taxus Indel-I-R :GTT CTG GCT TCC TCT AGC ATT TCA T (SEQ ID NO. 2)
[0025] (3) 4个红豆杉种的标准序列
[0026] 利用该条形码引物，经序列测定，分别构建了红豆杉属4个主要种的标准序列，包 括中国红豆杉、南方红豆杉、东北红豆杉和欧洲红豆杉，其中中国红豆杉有4个标准单倍型 (Htzhl至Htzh4,分别对应SEQ ID NO. 3至SEQ ID NO. 6所示序列）、南方红豆杉有2标准 个单倍形（Hmal至Hma2,分别对应SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 8所示序列）、东北红豆杉和 欧洲红豆杉各有一个标准单倍型，分别为Htc (SEQ ID NO. 9所示序列）和Htb (SEQ ID NO. 10 所示序列）。
[0027] (4)鉴别方法
[0028] 利用上述条形码引物，对待检物种DNA进行PCR扩增，PCR产物测序后通过序列比 对来鉴别红豆杉物种。若检测物种的序列长度为215bp (AAT插入），则该物种为中国红豆 杉。若检测物种序列长度为212bp (AAT缺失），参照不同种的标准序列，通过构建系统进化 树对待检测物种进行准确鉴别。
[0029] 鉴别方法具体如下：
[0030] A、待检物种的DNA提取
[0031] 改良CTAB法或DNA试剂盒都提取到符合质量要求的DNA，DNA纯度要求1. 8左右， 浓度符合PCR常规要求。
[0032] B、PCR 扩增
[0033] PCR 扩增体系共 10μ1，其中含 2XMultiplex master 缓冲液 5·0μ1，2μΜ 的正 向、反向引物各l.〇yl，5-10ng DNA模板1·0μ1，Η20 2·0μ1。PCR扩增程序为95C°预 变性151^11，接着35个循环的94°(：变性3〇8,60°(：退火9〇8,72°(：延伸6〇8，最后在60°(：延 伸30min，4°C保存。利用ExoSap去除PCR产物中的dNTPs和剩余引物，9. 0 μ 1的体系中 含6. 0 μ 1的ExoSap 100Χ稀释液、PCR产物3. 0 μ 1。混合液37°C温浴60min，80°C灭活 20min，4°C 保存。
[0034] C、PCR产物测序
[0035] PCR产物直接测序或克隆测序均可。直接测序方法为：PCR产物用BigDye? Terminator ν3· I Cycle Sequencing 试剂盒（Applied Biosystems)纯化处理。BigDye 纯 化体系共10 μ 1，其中含5X测序缓冲液2.0 μ 1，BigDye 0.5 μ 1，单引物（F或R) 1.0 μ 1， Η20 3. 5 μ 1，ExoSap处理后的PCR产物3. 0 μ 1。纯化程序为96 °C预变性2min，接着25个 循环的96°C变性10s，50°C退火5s，最后在60°C延伸4min，4°C保存。BigDye纯化产物再经 乙醇纯化