miRNA在肝硬化诊断和治疗中的应用_2

文档序号:8959627阅读:来源:国知局
0048] 1)在较少RNase干扰的清洁区,使用含适量液氮的研钵称取活检组织样本约 20mg,用件棒研磨至粉末状;
[0049] 2)将样本转移到一个不含RNA酶的2ml的离心管中;
[0050] 3)加入300 μ I Lysis solution,置于勾衆器内,充分研磨l_5min ;
[0051] 4) 12000g,4°C,离心10min,转移上清至新的I. 5ml的离心管中;
[0052] 5)加入 600 μ I RNase-Free Water,用漩祸器混勾;
[0053] 6)加入20 μ 1蛋白酶K,在55°C水浴锅中温浴15min,不断涡旋混匀;
[0054] 7) 14000g,室温,离心lmin,使细胞碎片沉淀于离心管底部,取上清转移到另外一 个不含RNA酶I. 5ml的离心管中;
[0055] 8)加入450 μ 1的95 %乙醇,涡旋混匀;
[0056] 9)取650 μ 1含乙醇的裂解液加到离心柱中,HOOOg离心Imin ;弃下层,将柱子重 新置于收集管中;
[0057] 10)依照裂解液的容量,重复步骤9);
[0058] 11)加入400 μ I Wash solution,14000g离心2min ;弃下层,将柱置于一新的收集 管中;
[0059] 12)加入 100 μ I Enzyme Incubation Buffer 和 15 μ I DNase I,14000g 离心 lmin,将收集管中的溶液重新移入柱中,室温放置15min ;
[0060] 13)加入400 μ I Wash solution,14000g离心lmin,弃下层,将柱子重新置于收集 管中;
[0061] 14)加入 400 μ I Wash solution,14000g 离心 2min,弃收集管,把柱子放入 I. 7ml Elution 管中;
[0062] 15)加入30 μ I Elution Buffer,200g离心2min,使溶液充分与柱结合;
[0063] 16) HOOOg离心lmin,将RNA使用无 RNA去离子水溶解,待用。
[0064] 3、RNA样品的质量分析(NanoDroplOOO分光光度计)
[0065] NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品,RNA-seq测序的样品要求:0D260/0D280 为 1. 8-2. 2〇
[0066] 将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量,在凝胶成像仪上观测、拍照,保存图像,一般认为 28S: 18S彡2可以初步判定总RNA质量较好。
[0067] 4、miRNA的提取和标记
[0068] 1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA,具体操作按照相应说明 书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下:1. 4 μ g miRNA 和 500ng 5' -磷酸盐-胞啼啶-尿啼啶 cy3_3'(Dharmacon,Chicago,USA)及 2 单 位T4RNAligase (NEB,Ipswich,USA),于4°C孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应 阴性对照。
[0069] 2)标记的RNA用0. 3M醋酸钠和2. 5倍体积的乙醇进行沉淀,再用15 μ 1 含3XSSC、0.2 % SDS和15%甲酰胺的杂交液重悬,所有的杂交重复两次,杂交用 LifterSlipTM(Erie,PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。
[0070] 3)将杂交室放在杂交仪 BioMixerTMII 上(CapitalBio Corp,Beijing,China)于 42 °C水浴过夜,用洗液洗两遍。
[0071] 5、miRNA 芯片操作:
[0072] miRNA芯片,采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片),按照说 明书的指示进行miRNA表达谱的检测。
[0073] 6、结果:
[0074] 分析miRNA芯片表达谱的检测结果,可知miRNA-548a_3p在肝硬化患者活检组织 中和健康人的活检组织中的表达存在显著差异,与健康人的活检组织相比,在肝硬化活检 组织中miRNA-548a-3p的水平显著降低。
[0075] 实施例2 QPCR验证差异表达的miRNA-548a-3p
[0076] 1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-548a_3p进行大样本QPCR验证。按照 实施例1中的样本收集方式选择肝硬化患者活检组织本和健康人活检组织样本各80例。
[0077] 2、RNA提取过程同实施例1。
[0078] 3、逆转录:
[0079] 1)按照表1配制反应体系
[0080] 表1反应体系 CN 105177149 A 说明书 6/7 页
[0082] 37cC孵育 Ih。
[0083] 2)反应管中加入 1 μ 1 0· 5 μ g/ μ I Oligo(dT)特异性 RT 引物,70°C孵育 5min。
[0084] 3)立即冰上孵育2min,打断RNA和引物的二级结构。
[0085] 4)将上述 20 μ 1 反应混合物与 4 μ I 5 X 缓冲液、1 μ I dNTP (IOmM),0· 5 μ I M-MLV 逆转录酶,〇. 5 μ 1核糖核酸酶(RNase)抑制剂,10 μ I polyA反应混合液和4 μ 1无核糖核 酸酶水(RNase free water)混合,42°C孵育 lh〇
[0086] 4、QPCR 反应:
[0087] 1)引物设计
[0088] 扩增 miRNA-548a_3p 的引物
[0089] 正向引物:CAAAACTGGCAATTACTTTTGC (SEQ ID NO. 2)
[0090] 反向引物:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO. 3)
[0091] 扩增U6snRNA的引物
[0092] 正向引物:CTCGCTTCGGCAGCACA (SEQ ID NO. 4)
[0093] 反向引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO. 5)
[0094] 2)按照表2配制PCR反应体系:
[0095] 其中,SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0096] 表2PCR反应体系
CN 105177149 A 说明书 7/7 页
[0098] 3)卩〇?反应条件:95。(:1011^11,(95。(:158,561€608)\40个循环。以5¥81?6代611 作为荧光标记物,在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应,以U6snRNA作为参照 基因,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,A ACT法进行相对定量。
[0099] 5、结果
[0100] 如图1所示,与健康人组织样本相比,肝硬化患者组织中miRNA-548a-3p的表达水 平显著降低,与miRNA芯片结果一致。
[0101] 实施例3研究miRNA-548a-3p对肝硬化细胞增殖能力的影响
[0102] 1、设计合成针对miRNA-548a-3p的模拟物
[0103] 根据miRNA-548a_3p的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成 miRNA-548a-3p模拟物和随机对照序列。
[0104] 2、细胞培养
[0105] 将肝星状细胞LX-2用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,于37°C、5% CO2的培 养箱中培养。
[0106] 3、细胞转染
[0107] 将LX-2细胞分为两组,分别为对照组、miRNA-548a_3p模拟物组。将对照组及模 拟物组分别转染随机对照序列和miRNA-548a-3p模拟物,运用转染试剂LipofectamineTM 2000进行转染,转染方法参照说明书。对照组和miRNA-548a-3p模拟物组的工作浓度均为 5 μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。
[0108] 4、QPCR 实验
[0109] 1)细胞总RNA提取:利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取, 按照说明书指示进行。
[0110] 2) QPCR :步骤同实施例2。
[0111] 结果如图2所示,与对照组相比,miRNA-548a-3p模拟物组的miRNA-548a-3p的水 平显著上升,表明miRNA-548a-3p模拟物能够有效促进miRNA-548a-3p的表达。
[0112] 5、细胞增殖实验
[0113] 将转染48h的LX-2细胞使用0. 25%胰酶消化成细胞悬液,以5X IO4个/ml接种 于96孔细胞培养板,每孔0. lml,60min后,MTT法测各孔490nm波长光吸收值。用光吸收 值大小代表活细胞的相对数量。
[0114] 6、结果
[0115] miRNA-548a-3p模拟物组相对光密度值为0. 237±0. 011,对照组相对光密度值 为I. 328±0. 043。与对照组相比,miRNA-548a-3p模拟物组光吸收值显著下降(P〈0. 05)。 上述实验结果表明miRNA-548a-3p模拟物能够显著抑制LX-2细胞增殖,同时表明 miRNA-548a-3p不利于LX-2细胞增殖。
[0116] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本 领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进 和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. miRNA-548a-3p在制备诊断患者是否患有肝硬化或处于肝硬化的风险中的产品中的 应用,其特征在于,所述产品包括能够检测miRNA-548a-3p的表达水平的试剂。2. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品包括芯片或试剂盒;其中, 所述芯片包括固相载体;以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探 针包括特异性地对应于miRNA-548a-3p的部分或全部序列;所述试剂盒包括用于检测 miRNA-548a-3p表达水平的试剂。3. 根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的检测miRNA-548a-3p表达水平的试 剂包括针对miRNA-548a-3p的引物和/或探针。4. 一种诊断患者是否患有肝硬化或处于肝硬化的风险中的产品,其特征在于,所述产 品包括权利要求1-3任一项所述的试剂。 5. miRNA-548a-3p在高通量测序平台中的应用,其特征在于,通过高通量测序检测 miRNA-548a-3p的表达水平,分析获知所述miRNA-548a-3p的表达异常与肝硬化的发生和 发展相关。 6. miRNA-548a-3p在制备治疗肝硬化药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述药物包含促进miRNA-548a-3p表达或 增强miRNA-548a-3p功能的试剂。8. 根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的试剂包括:miRNA-548a-3p的模拟 物、miRNA-548a-3p的前体、miRNA-548a-3p的激动剂、携带miRNA-548a-3p的载体。9. 一种治疗肝硬化的药物,其特征在于,所述药物包括权利要求7或8所述的试剂。10. 权利要求7或8所述的试剂在制备治疗肝硬化药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种miRNA在肝硬化诊断和治疗中的应用,所述miRNA是miRNA-548a-3p。通过检测miRNA-548a-3p的表达水平可用于诊断病人是否患有肝硬化或处于肝硬化的风险中。经实验证明,miRNA-548a-3p在肝硬化患者中表达水平明显低于健康人。在此基础上,miRNA-548a-3p还可以用于制备治疗肝硬化的药物。本发明大大提高了肝硬化诊断的敏感性和特异性,同时为肝硬化的基因治疗提供了新的靶点。
【IPC分类】C12Q1/68, A61K45/00, A61P1/16
【公开号】CN105177149
【申请号】
【发明人】高倩倩, 杨承刚
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月28日
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