泳检测，电泳缓冲液为I X TAE。电泳后的凝胶浸在0. 5g/ mL溴化乙锭染色液中染色15-20min，清水冲洗后，置于UV紫外成像系统上观察成像，并拍 照。
[0043] 将条带清晰且大小正确的PCR产物送至北京博迈德基因技术有限公司做正反双 向测序。将测序结果在NCBI网站上(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)利用BLAST下的 blastn模块与GenBank上已经发表的基因序列进行比对，确定菌株种类。
[0044] 根据病原菌形态学特征及分子生物学实验结果，参照文献（Yan J Y，Xie Yj Zhang Wj et al. Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China. Fungal Diver is i ty.2013,61:221-236. Dissanayake A，Liu M，Zhang ff?et al. Morphological and molecular characterization of Diaporthe species associated with grapevine trunk disease in China. Fungal Biology. 2015, 283-294. Jayawardena R，Zhang Wj Liu M，et al. Identification and characterization of Pestalotiopsis-Iike fungi related to grapevine diseases in China. Fungal Biology. 2015, 348-361赵奎华·葡萄病虫害原色图鉴[M].北京：中国农业出版社.2006: 12-17, 30-41，50-57, 74-77.)完成病菌种类鉴定。
[0045] 各个菌株的鉴定结果表明，与2. 1中柯赫氏法则鉴定结果一致。
[0046] 2. 3本发明的双重PCR方法鉴定
[0047] 以上述菌株的基因组DNA为模板，分别以引物对B. d-F/B. d-R和N. p-F/N. p-R进 行PCR扩增实验。以CldH2O为模板的PCR反应为阴性对照。
[0048] PCR反应体系为25 μ L，包括：待测样品DNA (5ng)，上游正向引物和下游反向引物 终浓度均为 〇· 2 μ mol/L，2 μ L dNTPs (即 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的终浓度各 2. 5mmol/L)， 2· 5 yL IOXPCR 缓冲液（lOOmmol/L Tris-HCl pH8.3,500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)和 0· 25 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，其余部分用ddH20补足。
[0049] PCR 反应程序为：94°C预变性 4min ;35 个循环的 94°C 30s，58°C 30s 和 72°C 30s ; 72°C延伸 IOmin。
[0050] PCR扩增产物用质量百分浓度2%琼脂糖凝胶电泳分析。结果分别见图I和图2。 图1结果表明供试的所有菌株中，只有3株Botryosphaeria dothidea扩增得到一条324bp 的DNA特异性扩增片段，其余菌株中均扩增不到任何条带；同样地，在图2中可见，所有供试 菌株中，除在3株Neofusicoccum parvum扩增到一条212bp的DNA特异性扩增片段外，其 余菌株中均扩增不到任何条带。
[0051] 上述结果表明，本发明对 Botryosphaeria dothidea 和 Neofusicoccum parvum 检测特异性100%。因此，引物对B. d-F/B. d-R和N. p-F/N. P-R特异性良好，可以分别用于 Botryosphaeria dothidea 和 Neofusicoccum parvum 的快速检测。
[0052] 3、引物 B. d-F/B. d-R 和 N. p-F/N. p-R 的灵敏性验证
[0053] 将菌株 Botryosphaeria dothidea 和 Neofusicoccum parvum 基因组 DNA 浓度调 整为1 μ g/μ L，按10的数量级逐步向下稀释至10 Vg/μ L作为模板，分别以引物B. d-F/ B. d-R和N. P-F/N. P-R进行PCR扩增，PCR体系和反应程序按照步骤2中所述，PCR产物 用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图3和图4,引物B. d-F/B. d-R对Botryosphaeria dothidea 的检测灵敏度为 10 5 μ g/ μ L，引物 Ν· p-F/N. p-R 对 Neofusicoccum parvum 的检 测浓度也为10 5 μ g/ μ L。
[0054] 4、引物 B. d-F/B. d-R 和 N. p-F/N. p-R 的双重 PCR 反应验证
[0055] PCR 反应体系为 25 μ L，包括：含有菌株 Botryosphaeria dothidea 和 Neofusicoccum parvum 的基因组 DNA(I-IOng)，引物 B. d-F/B. d_R 和 N. p-F/N. p-R 终浓度 均为 0· 2 μ mol/L，2 μ L dNTPs (即 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的终浓度各 2. 5mmol/L)，2· 5 μ L IOXPCR缓冲液（lOOmmol/L Tris-HCl ρΗ8· 3, 500mmol/L KC1，15mmol/L MgCl2)和0· 25 μ L Taq DNA聚合酶（5U/ μ L)，其余部分用ddH20补足。
[0056] PCR 反应程序为：94°C预变性 4min ;35 个循环的 94°C 30s，58°C 30s 和 72°C 30s ; 72°C延伸lOmin。PCR扩增产物用质量百分浓度2%琼脂糖凝胶电泳分析。结果见图5， 利用引物B. d-F/B. d-R和N. p-F/N. p-R可以在一个双重PCR反应体系中分别检测到 Botryosphaeria dothidea 和 Neofusicoccum parvum 的存在。
[0057] 利用该反应体系和反应程序对步骤2所述的菌株进行双重PCR检测，结果表明，供 试的所有菌株中，只有3株Botryosphaeria dothidea扩增得到一条324bp的DNA特异性 扩增片段，3株Neofusicoccum parvum扩增到一条212bp的DNA特异性扩增片段，其余菌株 中均扩增不到任何条带。
[0058] 同样，利用本发明的上述双重PCR反应体系和反应程序进行如步骤3)所述的灵敏 度检测，结果表明，将 Botryosphaeria dothidea 和 Neofusicoccum parvum 均检出的 DNA 添加浓度为10 5 μ g/ μ L。
【主权项】
1. 一组检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表 中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组 成。2. 根据权利要求1所述的检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物组，其特征在于：所述 葡萄溃疡病菌为小新壳梭孢（Neofusicoccumparvum)和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)〇3. -种同时检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea)和小新 壳梭孢（Neofusicoccumparvum)的试剂盒，包括权利要求1或2所述的双重PCR引物组。4. 根据权利要求3所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。5. 权利要求1或2所述的双重PCR引物组、权利要求3或4所述的试剂盒在检测小新 壳梭抱（Neofusicoccumparvum)和葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea)中的应用。 6?-种同时检测葡萄溃疡病菌中的小新壳梭孢（Neofusicoccumparvum)和葡萄座腔 菌（Botryosphaeriadothidea)的方法，包括下述步骤： 1) 提取待测样品DNA; 2) 以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的双重PCR引物组进行双重PCR扩增； 3) 鉴定步骤2)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个324bp的DNA特 异性扩增片段的待测样品鉴定为含有小新壳梭孢（Neofusicoccumparvum)的样品，将 扩增产物中含有一个212bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有葡萄座腔菌 (Botryosphaeriadothidea)的样品。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述双重PCR扩增的反应体系为25yL， 包括：待测样品DNA0. 01-0. 8ng/yL，序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所 示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸终浓度分别为 0.2以111〇1/1，（^1?、（101\(?^1\(11113的终浓度分别为2.5臟〇1/1，2.51^10\?0?缓冲液 和TaqDNA聚合酶终浓度为0. 05U/y1，其余部分用CldH2O补足；其中，IOXPCR缓冲液是由 lOOmmol/LTris-HClpH8.3,500mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2组成的溶液。8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：双重PCR反应条件为：94°C预变性4min; 35 个循环的 94°C30s，58°C30s和 72°C30s;72°C延伸lOmin。
【专利摘要】本发明公开了一组同时检测两种葡萄溃疡病菌的双重PCR引物及其应用。该组引物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。这组引物可以在一个双重PCR反应中分别检测到两种葡萄溃疡病菌-小新壳梭孢(Neofusicoccum？parvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria？dothidea)的存在，这表明该组引物可以快速、准确、灵敏的确定葡萄苗木以及田间葡萄病样中的上述两种葡萄溃疡病菌，为苗木带菌检测和针对性防治这2种病原菌引起的葡萄溃疡病提供依据。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/645
【公开号】CN105177148
【申请号】
【发明人】张玮, 燕继晔, 李兴红, 郭飞飞, 刘梅, 周莹, 陈震
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月23日