quencing of the important oilseed crop Sesamum indicum L. ，2013， Genome Biology ；Miao et al.， The sesame genome project and genome sequencing. XXII International Plant and Animal Genome Conference (San Diego, USA). 2014 (Conference poster abstract))， 选用BWA (Burrows- Wheeler Aligner)软件将各株系的测序数据进行拼接。
[0030] (3)利用Joinmap_linkage map软件构建芝麻F2群体SNP高密度遗传图谱。
[0031] 所构建遗传连锁图谱如图1所示。
[0032] 图谱共有13个连锁群，包含3101个Bin区段，12. 4万个标记，图谱全长1872. 2 cM，平均144.0 cM/连锁群，0.015 cM/标记区间。
[0033] (4)采用室内苗期芝麻抗枯萎病特性检测方法(仇存璞等，芝麻枯萎病病原茵致病 力室内鉴定方法，2014,植物病理学报）随机测定了 F2群体90个株系及2个亲本对高致病 力枯萎病菌HSF009095的抗性(芝麻植株人工感病处理过程参考前述【具体实施方式】部分内 容)。
[0034] 结果表明，匕代植株对枯萎病菌的病情指数（DI)范围为5~100。病情指数具体分 布如图2所示。
[0035] (5)结合上述SNP高密度遗传图谱，采用WinQTL cart软件确定了 1个与芝麻抗枯 萎病性状紧密连锁的主效位点其序列包括l〇7bp，具体序列为： AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAATGCAGCTTTTGCAATTGCTTCTCTTGTGCCTTTTCACATTCTGTTTTT GGGTTTTGCAAGAAGCTCCAATCCCTCCTATTTC。
[0036] 该位点位于第8连锁群，位置为111. 5-112. 7cM区间，R2值为51. 66%，P值< 0. 001 (结果如图3所不)。
[0037] 需要说明的是，上述SNP位点序列中第25个碱基A，当A变为G时，即为SNP等位 位点，但此时植株抗病性往往发生显著变化，多表现为感病。
[0038] 实施例2:与芝麻抗枯萎病紧密连锁的分子标记验证 本实施例主要介绍对于与芝麻抗枯萎病紧密连锁的分子标记^碰]验证，即该 分子标记的检测方法，包括以下步骤： (1) 2014年7月，在河南省农业科学院芝麻研究中心原阳基地利用芝麻高抗枯萎病品 系豫芝DS899 (DI 6.1%)、高感枯萎病种质JS012 (DI 100%)配置杂交组合，获得Fp
[0039] 2014年11月，在三亚基地种植F1代种子，单株罩网自交，随后获得F 2代种子，群 体大于200株。
[0040] 2015年2月，随机选取50个？2单株的饱满种子，采用室内苗期芝麻抗枯萎病特性 检测方法进行F2株系后代苗期枯萎病抗性水平鉴定。选用高致病力枯萎病菌HSF009095进 行接菌侵染，每个株系设定4个重复，每个重复处理10棵植株(芝麻植株人工感病处理过程 参考前述【具体实施方式】部分内容)。
[0041] 调查结果显示，匕代植株对枯萎病菌的病情指数（DI)范围为5~100。在50个F2后代中，表现为高抗（0 < DI < 15)的植株数为2株；抗病（15 < DI < 30)的为2株；中抗 (30 < DK 55)的为13株；感病（55 < DK 70)的为14株，高感（70 < DK 100)的为 19株。
[0042] (2)设计引物，利用Primer Premier 5. 0软件，依据实施例1中分子标记 勺序列，设计相应的TPFLD-PCR (三引物荧光定量PCR)引物，具体SNP引物设计 方法参照Wei 等（Development of SNP and InDel markers via de novo transcriptome assembly in L.，2014，Molecular Breeding)进行，引物序列设计如下： 正向引物 I Primer 9-1F 序列为：5' AGATGTITTAAAAAGAGACAGTAAA 3' ； 正向引物 2 Primer 9-2F 序列为：5' ATACAAGATGTITTAAAAAGAGACAGTAAG 3' ； 反向引物 Primer 9-R 序列为：5' GAAATAGGAGGGATTGGAGC 3' ； 需要说明的是，为区分被检测基因组DNA不同SNP等位位点，同时为了不同位点的PCR 产物在后续凝胶电泳图谱区分能够较为便捷的区分开来，正向引物2 Primer 9-2F的5'端 前5个碱基为随机增加。
[0043] 上述SNP引物由华大基因公司合成。
[0044] (3)利用上述SNP标记引物对对上述F2群体的50个单株个体进行检测，从而评价 SNP标记的可靠性。
[0045] 需要解释的是，在用步骤（2)中所设计引物进行芝麻材料基因组DNA扩增时，以正 向引物1和反向引物扩增的PCR产物大小为107bp ;以正向引物2和反向引物扩增的PCR产 物大小为112bp。
[0046] PCR扩增时以F2群体50个单株和2个亲本个体所提取DNA为模板，DNA提取采用 CTAB法提取。
[0047] PCR反应采用10 PL反应体系，设置如下： 模板 DNA (50ng/^L)，I. 〇μL ; 10XPCR Buffer (Mg2+), 1. 〇μL ； Taqase 酶（5U/>L)，0· 2μL ; dNTP (lOmmol/L),0. 2μL ； Forward Primer 1 (1〇μΜ) ,0. 5)J-L ； Forward specific Primer 2 (1〇μΜ), 0. 5)J-L ； Reverse Primer (1〇μΜ), I. 0)J-L ； 加入超纯水5. 6PL。
[0048] 上述相关试剂均购自于上海生工试剂公司。
[0049] PCR反应在PTC-100 (MJ research公司产品）热循环仪上进行，反应程序为：95°C 预变性 3min ;94°C变性 30sec，53°C退火 30 sec，72°C复性 lmin，30 个循环；72°C延伸 6min ; 14°C保温 lmin。
[0050] (4)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离。
[0051] 对步骤（3)中PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，凝胶浓度为8~10%， 凝胶大小180mmX 120mmX2mm，电泳缓冲液为0. 5XTBE，150V恒压交流电电泳1. 5~2小时。
[0052] 电泳结束后，在凝胶加入浓度为0. 1%的硝酸银水溶液，置于水平摇床上渗透银染 IOmin ;再加入2%氢氧化钠和0. 4%甲醛混合溶液，置于水平摇床中适度显色；最后清水漂 洗凝胶并记录读取数据。
[0053] 部分电泳图谱如图4所示。
[0054] (5) SNP分子标记检测与被检测样品抗枯萎病水平一致性分析。
[0055] 从必位点筛选过程我们可以知晓，理论上具有SiFWR2145等位位点1 (条 带大小107bp，即本申请&7^^7必位点）的植株应该表现为抗病（或多数表现为抗病）；具 有SiFWR2145等位位点2 (条带大小112bp，即必位点中第25个碱基A变为G时 位点）的植株应该表现为感病。
[0056] 检测结果显示，在有SiFWR2145等位位点1 (条带大小107bp)的4个植株中，有2 株表现为抗枯萎病（DI < 30)，可靠度为50% ; 在有SiFWR2145等位位点2 (条带大小112bp)的30个植株中，有19株表现为高感枯 萎病（DI > 70)，可靠度为63. 33%。
[0057] SiFWR2145杂合型植株(有107bp、112bp两条带）则多表现为中等抗性 (55彡DI彡70)(部分植株PCR扩增结果如图4所示)。
[0058] 综上，我们可以认为该SNP标记与抗枯萎病主效基因紧密连锁，具有较好地可靠 性和稳定性，可以用于预测芝麻品种的枯萎病抗性水平，即可以用于抗枯萎病芝麻新品种 培育。
【主权项】
1. 一种与芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的分子标记57/^於745，其特征在于，该标记包 含107bp，其序列如SEQIDNo. 1所示，具体为： AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAATGCAGCTTTTGCAATTGCTTCTCTTGTGCCTTTTCACATTCTGTTTTT GGGTTTTGCAAGAAGCTCCAATCCCTCCTATTTC。2. 权利要求1所述分子标记^碰]检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤： (1)提取待测芝麻种子资源的基因组DNA; (2 )设计引物序列，具体设计如下： 正向引物IPrimer9-1F序列为：5'AGATGITTTAAAAAGAGACAGTAAA3' ； 正向引物 2Primer9-2F序列为：5'ATACAAGATGITTTAAAAAGAGACAGTAAG3' ； 反向引物Primer9-R序列为：5'GAAATAGGAGGGAITGGAGC3' ； 以步骤（1)中所提取DNA为模板，进行PCR扩增； (3)对步骤（2)中PCR扩增产物进行凝胶电泳，判断待测芝麻种子资源的基因组DNA中 是否含有分子标记必，如果含有分子标记必，则表明待测芝麻种子资源遗 传组中含有与该标记紧密连锁的抗枯萎病基因，可以用于培育新的抗枯萎病芝麻品种；如 果不含有该分子标记57/^^745，则表明待测芝麻种子资源遗传组中不含有抗枯萎病基因， 不适宜用于培育抗芝麻枯萎病新品种。3. 权利要求1所述分子标记必在芝麻育种中的应用，其特征在于，采用分子辅 助育种方法进行芝麻育种时，含有该分子标记的芝麻材料可以用于培育抗枯萎病芝麻新品 种。
【专利摘要】本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的SNP分子标记<i>SiFWR2145</i>。该标记在芝麻SNP遗传图谱中的位置为111.5~112.7cM，位于第8连锁群，对抗枯萎病病指的解释率为51.66%（Vg/Vp），该标记包含107bp，其序列如SEQ？ID？No.1所示。与现有芝麻育种方法相比，本发明主要优点有：（1）本发明针对芝麻育种技术进行创新，与目前应用的常规育种技术方法相比，检测方法简单高效，结果可靠；（2）本发明所提供分子标记<i>SiFWR2145</i>，用于分子辅助育种时可以显著提高育种效率，节约科研成本和时间，并为完善芝麻分子育种技术平台奠定坚实基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105177129
【申请号】
【发明人】苗红梅, 张海洋, 魏利斌, 李春, 段迎辉, 常淑娴
【申请人】河南省农业科学院芝麻研究中心
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月25日