进行下一步实验；使用酶切方法，如果酶切的效率低也会产生假阴性的结果；使 用琼脂糖电泳，分辨率较低。
【附图说明】
[0030] 图1为荧光PCR对敲除小鼠鉴定结果图；其中A为野生型小鼠、B为双敲小鼠、C为 单敲小鼠；
[0031] 图2为Founder小鼠部分基因组测序图（敲除部分测序序列），其中有套峰存在， 说明利用Cri spr/Cas9系统敲除C57BL/6J小鼠的microRNA-505基因敲除成功，被敲除了 23bp〇
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0033] 实施例1
[0034] (1)小鼠饲养和样本采集：将经鉴定过的Founder小鼠（本人使用Crispr/Cas9 系统敲除mircoRNA 505 (Gene ID: 751545)的C57BL/6J小鼠作为Founder小鼠，经鉴定该 Founder小鼠敲除23bp，记为Founderl7)与C57BL/6J小鼠杂交产生Fl代小鼠。取Fl代 小鼠 Icm尾组织，一 20°C保存备用。
[0035] (2) DNA抽提：将（1)中尾组织采用生工生物工程有限公司的动物基因组DNA抽提 试剂盒，按照说明书进行抽提得到DNA，以0. 8%琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量和浓度。
[0036] (3)引物设计：在CriSpr/CaS9系统敲除的基因位点区域设计一对PCR引物，根 据NCBI数据库中C57BL/6J小鼠的microRNA505的序列，使用Primer3在线软件（http:// frodo. wi. mit. edu/primer3/)进行初步引物设计，再利用oligo6人工设计，并由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成，且在上游引物的5'端使用FAM荧光修饰，下表即为所设 计的引物。
[0037] TableL 荧光 PCR 引物
[0038] CN 105177126 A 说明干ι 4/4 页
[0039] 注：505-377-L引物5'端使用6' FAM修饰。
[0040] 荧光PCR技术鉴定：将50ng的Fl代小鼠尾巴DNA 3 μ L加入到Taq酶体系中，其中 Taq 酶体系包含 1.5 yL 200ηΜ 上下游引物、1.5 yL 0.25mM 的 dNTP，5 yL 10XPCR Buffer， 1 μ L的1单位Taq酶，并使用矿物油覆盖；同时设阴性对照。PCR反应程序为：95°C变性 5min ;94°C变性 30s，56°C复性 lmin30s，72°C延伸 lmin，35 个循环，72°C lOmin，经过 PCR 扩 增后，将PCR产物稀释5倍后等体积地与ROX混合，吸取Iul上样到377测序仪上，功率为 30W，电泳时间为2h ;
[0041 ] 使用GeneScanTM672 (AppliedBiosystems)软件将377测序仪上电泳分离的结果 进行数据采集，然后使用Genemapper软件（(AppliedBiosystems))对采集数据进行分析， 分析得到的PCR产物检测峰的数目及位置，计算出PCR产物大小，进行鉴定。
[0042]图1即为分析结果，通过检测峰的数目以及位置可以轻易分辨野生，双敲，单敲的 老鼠（野生老鼠产物大小为112bp，单峰，图1中A ;双敲小鼠产物大小为89bp，单峰，图1中 B ;单敲小鼠产物大小为89bp/112bp，双峰，图1中C)。
【主权项】
1. 一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，包括： (1) 利用Crispr/Cas9系统敲除mircoRNA的C57BL/6J小鼠，得到Founder小鼠；将 Founder小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，得到Fl代小鼠，Fl代杂合小鼠得到F2代； (2) 分别取上述F1、F2代小鼠尾组织，然后提取DNA; (3) 在Crispr/Cas9系统敲除的基因位点区域设计一对PCR引物，且在上游引物的5' 端使用FAM荧光修饰，得到荧光引物； (4) 将荧光引物对步骤（2)中的DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物与分子内标混合， 在测序仪上经过电泳分离，鉴定。2. 根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于： 所述步骤（1)中mircoRNA为mircoRNA505。3. 根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于： 所述步骤（3)中引物为：L:5'AAACCAGCAAGTGITGACGC3'；R:5'CCCTGTITGTCACTTGCAGA3'。4. 根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于： 所述步骤⑶中FAM为6'FAM。5. 根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在 于：所述步骤（4)中PCR扩增具体为：3yLDNA加入到Taq酶体系中，其中Taq酶体系包含 1.5yL200nM上下游引物、1.5yL0.25mM的dNTP，5yLIOXPCRBuffer，lyL的 1 单位 Taq酶，并使用矿物油覆盖；同时设阴性对照，反应程序为：95°C变性5min;94°C变性30s， 56°C复性lmin30s，72°C延伸lmin，35 个循环，72°C，lOmin。6. 根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于： 所述步骤（4)中在测序仪上经过电泳分离为：在377测序仪上经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离，其中测试仪功率为30W，分离时间为2h。7. 根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于： 所述步骤（4)中分子内标为携带ROX的已知片段大小的DNA，其中已知片段大小的DNA的片 段大小为 79、105、131、151。8. 根据权利要求1所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于： 所述步骤（4)鉴定具体为：将测序仪上电泳分离的结果进行数据采集，然后对采集的数据 进行分析，分析PCR产物检测峰的数目及位置，计算出PCR产物大小，进行鉴定。9. 根据权利要求8所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在于： 检测峰的数目：单峰为纯合，双峰为杂合；检测峰的位置：峰的位置代表产物片段大小。10. 根据权利要求8所述的一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，其特征在 于：野生老鼠产物大小为112bp，检测峰位于右侧，为单峰；双敲小鼠产物大小为89bp检测 峰位于左侧，为单峰；单敲小鼠产物大小为89bp，左侧峰，112bp为右侧峰，为双峰。
【专利摘要】本发明涉及一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，利用荧光PCR引物，经PCR扩增后将产物与已知片段大小的ROX混合，利用377测序，使用Genemapper软件计算出PCR产物的大小，从而达到鉴定小鼠基因型的目的，即可。本发明简单直接准确的鉴定出Crispr/Cas9敲除的mircoRNA小鼠。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105177126
【申请号】
【发明人】肖君华, 李 雨, 王茂春, 仝莉, 周宇荀
【申请人】东华大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月21日