玉米细胞质雄性不育(cms)c型恢复系rf4基因、分子标志物及其用图
【专利说明】玉米细胞质雄性不育（CMS)C型恢复系RF4基因、分子标志 物及其用途
[0001] 本申请是2011年9月26日提交的申请号201180058697. 2(国际申请号PCT/ US2011/053304、发明名称为"玉米细胞质雄性不育（CMS)C型恢复系RF4基因、分子标志物 及其用途"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 优先权要求
[0003] 本申请要求2010年10月6日提交的美国临时专利申请流水号61/390, 526和2011 年9月23日提交的非临时专利申请流水号13/244,049均关于"MAIZE CYTOPLASMIC MALE STERILITY (CMS) C-TYPE RESTORER RF4GENE, MOLECULAR MARKERS AND THEIR USE"的提交日 权益。
技术领域
[0004] 本公开内容涉及植物能育性基因。在一些实施方案中，公开内容涉及Rf4,即 能育性基因的玉米恢复系。在具体的实施方案中，公开内容涉及用于对C型细胞质雄性 不育（CMS-C)恢复能育性的组合物和方法，其例如通过使用与Rf4基因连锁的，或驻留 (residing)于Rf4基因内的分子标志物来进行。具体实施方案涉及使用特定核酸序列来鉴 定包含CMS-C的能育性恢复系的植物，及用于杂种种子生成的方法。一些具体的实施方案 涉及与CMS-C的能育性恢复有关的多肽。
【背景技术】
[0005] 杂种植物育种的开发已经使得有可能在生产作物的质量和数量方面获得相当大 的进展。产量增加和期望特征（诸如对疾病和昆虫的抗性、热和干旱耐受性、和植物组成的 变化）的组合部分由于杂交规程而均是有可能的。杂交规程依赖于对雌性亲本植物贡献来 自雄性亲本植物的花粉以生成所得的杂种。
[0006] 如果来自一朵花的花粉转移到同一植物的同一或另一朵花，那么植物可以自花传 粉。如果花粉起源于来自不同植物的花，那么植物可以异花授粉。可以通过自花传粉和异 花授粉技术两者育种玉米植物（玉蜀黍（Zea mays))。玉米植物具有雄花（其位于雄穗 (tassel)上）和雌花（其位于同一植物的穗上）。在来自雄穗的花粉达到存在于接受穗顶 部的丝时发生玉米中的天然传粉。玉米杂种的形成依赖于雄性不育系统。
[0007] 玉米杂种的形成需要纯合近交系的形成、这些品系的杂交、以及杂交的评估。谱系 育种和轮回选择是用于从群体形成近交系的两种育种方法。育种程序将来自两种或更多种 近交系或各种广泛来源的期望性状组合到育种集合中，通过自交和期望表型的选择从所述 育种集合开发新的近交系。杂种玉米品种是两种此类近交系的杂交，每种所述近交系可以 具有一种中缺乏或互补另一种的一种或多种期望的特征。将新的近交植物与其它近交系杂 交，并评估来自这些杂交的杂种以测定哪些是期望的。来自第一代的杂种后代称作F1。在 杂种的开发中，仅寻求匕杂种。？1杂种通常比其近交亲本更有力。例如，此杂种活力（称 作杂种优势）通常导致增加的营养生长和增加的产量。
[0008] 可以通过掺入手动去雄的雄性不育系统生成杂种玉米种子。为了生成杂种种子， 将雄穗从生长中的雌性近交亲本除去，所述雌性近交亲本可以与雄性近交亲本以各种交替 行样式种植。因此，倘若从外来玉米花粉有足够的分离，雌性近交物的穗仅会用来自雄性近 交物的花粉受精。所得的种子是杂种F1种子。
[0009] 手动去雄是劳动密集的且昂贵的。手动去雄还经常是无效的，例如因为植物发育 中的环境变化可以导致完成雌性亲本植物的手动去雄后植物雄穗抽穗（tasseling)，或者 因为去雄者（detasseler)不可能完全除去雌性近交植物的雄穗。若去雄是无效的，则雌性 植物会成功脱落花粉，并且一些雌性植物会自花传粉。这会导致雌性近交物的种子与正常 生成的杂种种子一起收获。雌性近交物种子不如F1种子那样多产。另外，雌性近交物种子 的存在可以对杂种种子生产者呈现种质安全性风险。
[0010] 也可以通过机器将雌性近交植物机械去雄。机械去雄大致与手动去雄一样可靠， 但是更快且不太昂贵。然而，大多数去雄机器比手动去雄对植物产生更多损伤。如此，没有 去雄形式目前是完全令人满意的。
[0011] 遗传雄性不育是一种可以在杂种种子生成中使用的备选方法。可以通过使用细胞 质雄性不育（CMS)近交植物在一些基因型中避免费力的去雄过程。与核基因组形成对比， 在缺乏能育性恢复系基因的情况下，CMS近交物植物由于源自细胞质的因素而雄性不育。因 此，雄性不育的特征经由玉米植物中的雌性亲本而得到专门遗传，因为仅雌性对受精种子 提供细胞质。用来自非雄性不育的另一近交物的花粉使CMS植物受精。来自第二近交物的 花粉可以贡献或没有贡献使杂种植物雄性不育的基因。通常，必须混合来自去雄正常玉米 的种子和相同杂种的CMS生成的种子以保证足够的花粉负荷在种植杂种植物时可用于受 精，并且确保细胞质多样性。
[0012] CMS作为生成杂种种子的系统的缺点包括CMS的特定变体与对某些作物疾病的易 感性的关联。参见例如Beckett (1971)Crop Science 11:724-6。特别地，此问题已经阻碍 CMS-T变体在杂种玉米种子的生产中使用，而且一般地，已经对CMS在玉米中的使用具有负 面影响。
[0013] 细胞质雄性不育（CMS)是母系遗传的没有生成功能性花粉的能力。已经发现了 超过40种CMS来源，并且根据玉米中差异的能育性恢复反应而分成三大组。这些组称为 CMS-T(Texas)、CMS-S (USDA)和 CMS-C (Charrua)。Beckett (1971)。在 CMS-T 组中，两种显性 基因 Rfl和Rf2 (其分别位于染色体3和9上）是花粉能育性的恢复需要的。Duvick (1965) Adv. Genetics 13:1-56。S-细胞质通过单一基因 Rf3 (其已经在染色体2中定位）恢复。 Laughnan and Gabay(1978) "Nuclear and cytoplasmic mutations to fertility in S male-sterile maize, '，in Maize Breeding and Genetics, pp. 427~446〇
[0014] 与CMS-T和CMS-S相比，已经发现了 CMS-C的能育性恢复在先前的分析中是非 常复杂的。Duvick(1972), "Potential usefulness of new cytoplasmic 雄性 sterile and sterility system, " 于 Proceeding of the 27th annual corn and sorghum research conference, pp. 197-201，发现了 CMS-C中能育性的完全恢复受到Rf4基因的 显性等位基因控制。Khey-Pour等（1981)还发现了此基因对于CMS-C恢复是足够的。然 而，Josephson 等（1978)， "Genetics and inheritance of fertility restoration of 雄性 sterile cytoplasms in corn, '，于 Proceedings of the 33rd corn and sorghum research conference 7:13,提出CMS-C中能育性的完全恢复以两种基因 Rf4和Rf5 (其 后来已经分别在染色体8和5上定位）的显性等位基因的互补作用为条件。SisC〇(1991) Crop Sci. 31:1263-6。同时，Chen 等（1979) Acta Agronom. Sin. 5 (4) :21-28 认为 CMS-C 中 的两种显性恢复系基因具有重复功能。使该系统进一步复杂，Vidakovic (1988) ,Maydica 33:51-65证明CMS-C中能育性的完全恢复存在三种显性且互补的基因，添加基因 Rf6。 Vidakovic 等，（1997a)Maize Genet. Coop.News Lett.71:10;(1997b)Maydica 42:313-6 后来报告了这些互补基因 Rf4、Rf5、和Rf6实际上不是玉米CMS-C中能育性恢复的唯一遗 传系统。如此，CMS-C的能育性恢复机制仍然没有解决。因此，难以为一些基因型不育系选 择恢复系品系。
[0015] 分子标志物特别可用于加速经由回交将基因或数量性状基因座（QTL)导入良 种栽培种或育种系中的方法。可以使用与基因连锁的标志物来选择拥有期望性状的植 物，并且可以使用遍及基因组的标志物来选择在遗传上与回归亲本相似的植物（Young and Tanksley(1989)Theor.Appl.Genet.77:95_101;Hospital 等（1992)Genetics 132:1199-210)〇
[0016] 已经经由基于图谱的克隆策略克隆出大多数植物能育性恢复系基因。至今，已 经从几种植物物种分离出9种Rf基因，所述植物物种包括玉米（玉蜀黍）（Cui等（1996) Science 272:1334-6 ;Liu 等（2001)Plant Cell 13:1063-78)、矮牵牛（Petunia)(碧冬 前（Petunia hybrida))(Bentolila 等（2002)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 99:10887-92)、 萝卜（萝卜（Raphanus sativus L·)) (Brown等（2OO3)Plant J. 35:262_72;Desloire 等 (2003)EMBO R印.4:1-7 ;Koizuka 等（2003)Plant J. 34:407-15)、高粱（高粱（Sorghum bicolor L·)) (Klein 等（2005)Theor.Appl. Genet. 111:994-1012)、稻（稻（Oryza sativa L.))(Kazama and Toriyama (2003) FEBS Lett. 544:99-102 ;Akagi 等（2004) Theor.Appl. Genet. 108:1449-57 ;Komori 等（2004)Plant J. 37:315-25 ;Wang 等（2006)Plant Cell 18:676-87 ;及Fujii and Toriyama(2009)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (23):9513-8)、和 沟酸楽 (Mimulus guttatus) (Barr and Fishman(2010)Genetics 184:455-65)。
[0017] 除了玉米中的Rf2和稻中的Rfl7外，所有鉴定的恢复系基因编码不同三角状 五肽重复（pentatricopeptide repeat，PPR)蛋白质。植物基因组编码几百种PPR蛋 白，它们有许多牵涉调节细胞器基因表达。Lurin等（2004)Plant Celll6:2089-103;及 Schmitz-Linneweber and Small(2008)Trends Plant Sci. 12:663-70。卩卩1?蛋白含有35 个 氨基酸（称作 PPR 基序）的 2至 27 个重复。Small and Peeters, (2000) Trends Biochem. Sci. 25(2) :46-7。预测 PPR 蛋白结合 RNA(Delannoy 等（2007)Biochemical Society Transactions 35:1643-7)，并且许多PPR蛋白靶向至线粒体，在那里定位CMS关联基因和 产物。Lurin等（2004)，见上文。证据提示了 PPR蛋白直接结合CMS转录物。Akagi等（2004)， 见上文；Gillman 等（2007)Plant J. 49:217-27 ;及 Kazama 等（2008)Plant J. 55:619-28〇Rf蛋白通过改变其加工样式（Kazama&Toriyama(2003)，见上文），降低RNA稳定性（Wang 等（2006)，见上文；及Ohta等（2010)Plant Cell R印.29:359-69)，或者阻止它们被翻译 (Kazama等（2008)，supra)来降低CMS关联转录物的表达。
[0018] 关于来自玉米、稻、矮牵牛、和萝卜的能育性基因的恢复系的更多信息可以参见 美国专利申请流水号 US2006/0253931，and in U.S.Patent Nos.5,981，833;5,624,842; 4, 569, 152 ;6, 951，970 ;6, 392, 127 ;7, 612, 251 ;7, 314, 971 ;7, 017, 375 ;7, 164, 058 ;和 5, 644, 066。
【发明内容】
[0019] 本文中描述了将玉米Rf4基因座定位至位于染色体8顶部的小的12kb区。在此 区内，Rf4的唯一可能的候选物是编码bHLH转录因子的基因。通过从CMS-C非恢复系和 恢复系品系克隆Rf4_bHLH基因座，鉴定出许多序列变异。在蛋白质水平，CMS-C系和非恢 复系品系都具有相同的序列，并且与恢复系等位基因（也彼此相同）相差4处氨基酸变化 (4amino_acid changes)，包括bHLH域内的保守的、亲水性酪氨酸残基（Y186)，其改变为恢复 系品系中疏水性苯丙氣fe残基（F187)。
[0020] 在本文中鉴定出玉米Rf4基因及其编码多肽，并且另外描述了包含Rf4基因序列 的核酸分子。令人惊讶地，Rf4基因不是一种三角状五肽重复（PPR)蛋白质基因，几乎所有 其它能育性恢复系基因亦然。此外，证明了本发明的CMS-C/Rf4系统种质中的能育性恢复 受到作为单一显性恢复系基因的Rf4控制，这由于几个小组的新近工作而是意想不到的。 参见，上文。玉米rf4-bHLH的bHLH域内的亲水性酪氨酸残基（Y186)(其在恢复系品系中改 变为疏水性苯丙氨酸残基（F187))在单子叶植物间是保守的。如此，Rf4基因和Rf4基因标 志物的鉴定可以极大地促进在植物种质中广泛开发和部署CMS-C能育性恢复性状。
[0021] 在实施方案中，rf4-bHLH第186位保守酪氨酸残基突变为疏水性氨基酸残基（例 如，苯丙氨酸）造成Rf4-bHLH多肽中的恢复系表型。如此，本文中描述了在所述位置（如 通过序列比对鉴定的）处编码疏水性氨基酸残基的玉米Rf4-bHLH或玉米Rf4-bHLH基因的 直向同系物，其中这些基因在导入植物中时促成CMS-C表型的恢复系。
[0022] 本文中描述了与玉米Rf4基因连锁（例如，连锁；紧密连锁；或极端紧密连锁）或 驻留于玉米Rf4基因内的核酸分子标志物。在一些实施方案中，可以使用与玉米Rf4基因 连锁（例如，连锁；紧密连锁；或极端紧密连锁）或驻留于玉米Rf4基因内的标志物，或玉米 Rf4基因序列自身将玉米Rf4基因导入生物体，例如植物（例如，玉米和其它单子叶植物） 中。
[0023] 本文中还描述了使用与Rf4基因连锁或驻留于Rf4基因内的核酸分子标志物（例 如但不限于）以鉴定具有C型CMS的功能性恢复系基因的植物；以将Rf4导入新的植物基 因型（例如，经由标志物辅助育种或遗传转化进行）；以及以从包含与Rf4基因连锁或驻留 于Rf4基因内的核酸分子标志物的雄性植物和携带C型CMS的雌性植物杂交生成杂种种子 的方法。
[0024] 进一步描述了用于对CMS-C玉米恢复能育性的手段，以及用于鉴定携带对CMS-C 玉米恢复能育性的基因的植物的手段。在一些例子中，用于对CMS-C玉米恢复能育性的手 段可以是与玉米Rf4基因连锁（例如，连锁；紧密连锁；或极端紧密连锁）或驻留于玉米Rf4 基因内的标志物。在一些例子中，用于鉴定携带对CMS-C玉米恢复能育性的基因的植物的 手段可以是探针，该探针与同玉米Rf4基因连锁（例如，连锁；紧密连锁；或极端紧密连锁） 或驻留于玉米Rf4基因内的标志物特异性杂交。
[0025] 本文中还描述了可以从包含与玉米Rf4基因连锁（例如，连锁；紧密连锁；或极端 紧密连锁）或驻留于玉米Rf4基因内的核酸分子标志物的雄性植物和携带C型CMS的雌性 植物杂交生成杂种种子的方法。此类杂种种子的生成由于消除手动或机械去雄而可以导致 成本节约，而且可以进一步提高种子产量。
[0026] 进一步描述了使用本文中公开的核酸分子来鉴定来自与玉米不同的植物物种的 同源Rf4序列的方法（例如，通过序列比较来进行）。在一些实施方案中，在与玉米不同的 植物物种中工程化改造杂种种子生成的CMS_C/Rf4系统。
[0027] 更具体地，本公开涉及：
[0028] 1. -种用于鉴定包含玉米C型细胞质雄性不育的功能性恢复系基因的植物的方 法，该方法包括：
[0029] 自植物分离核酸分子；和
[0030] 对分离的核酸分子筛选如下的核酸分子，该核酸分子包含选自由SEQ ID NO: 1-197组成的组的核苷酸序列和表3中称为多态性ID No. 1-106的标志物，或其等同 物，其中包含选自由SEQ ID NO: 1-197组成的组的核苷酸序列和表3中称为多态性ID No. 1-106的标志物，或其等同物的核苷酸序列的至少一种核酸分子的存在指示玉米C型细 胞质雄性不育的功能性恢复系基因。
[0031] 2.依照项1的方法，其中所述分离的核酸分子包含如下的核酸分子，该核酸分子 包含选自由SEQ ID NO: 1-197组成的组的核苷酸序列和染色体8上在表3中称为多态性ID No. 1-106的标志物。
[0032] 3.依照项1的方法，其中所述分离的核酸分子是基因组DNA。
[0033] 4.依照项1的方法，其中使用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应实施对所述 分离的核酸分子筛选如下的核酸分子，该核酸分子包含选自由SEQ ID NO: 1-197组成的组 的核苷酸序列和表3中称为多态性ID No. 1-106的标志物，或其等同物。
[0034] 5.依照项1的方法，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID N0:6-9 ;SEQ ID N0:105；SEQ ID N0:109；SEQ ID N0:111；SEQ ID N0:115；SEQ ID NOs: 118-120 ；SEQ ID N0:123；SEQ ID N0:126；SEQ ID N0:134；SEQ ID N0:135；SEQ ID N0:137；SEQ ID NO: 138； SEQ ID N0:144；SEQ ID N0:149；SEQ ID NO: 151 ；SEQ ID N0:160；SEQ ID N0:163；SEQ ID NO: 164 ；SEQ ID NO: 167 ；SEQ ID NO: 173 ；SEQ ID NO: 177 ；SEQ ID NO: 178 ；SEQ ID NO: 183 ； SEQ ID NO: 189-191 ;SEQ ID NO: 197 ;及表 3 中称为多态性 ID No. 1-106 的标志物。
[0035] 6.依照项5的方法，其中所述核苷酸序列选自由SEQ ID N0:8和DAS-CMS1-34组 成的组。
[0036] 7.依照项5的方法，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 126,和 SEQ ID NO: 134,以及表 3 中称为多态性 ID No. 1-106的标志物。
[0037] 8.依照项1的方法，进一步包括表3中称为多态性ID No. 1-106的每种标志物测 定所述植物的基因型。
[0038] 9.通过依照项1的方法鉴定的植物。
[0039] 10.依照项9的植物，其中所述植物在与具有响应玉米C型细胞质雄性不育性状的 植物杂交时没有生成大量半能育植物。
[0040] 11. 一种用于分离玉米中的Rf4基因的方法，该方法包括：
[0041] 将具有C型细胞质雄性不育性状的雄性不育玉米植物与具有响应C型细胞质雄性 不育性状的雄性不育恢复系玉米植物杂交以生成F1玉米植物；
[0042] 将所述F1玉米植物自交以生成F 2玉米植物；
[0043] 将多个所述匕玉米植物的能育性表型分类；
[0044] 测定与自所述多个F2S米植物之每个分离的基因组DNA的染色体8的位置86247 到位置98188对应的区域的至少一部分的核苷酸序列；
[0045] 鉴定与染色体8的位置86247到位置98188对应的区域内与恢复的能育性表型具 有最高连锁频率的编码序列，其中鉴定的编码序列是玉米中的Rf4基因。
[0046] 12.依照项11的方法，其中所述具有C型细胞质雄性不育性状的雄性不育玉米植 物是 BE4207。
[0047] 13.依照项11的方法，其中所述具有响应C型细胞质雄性不育性状的雄性不育恢 复系玉米植物是XJH58。
[0048] 14.依照项11的方法，其中所述具有C型细胞质雄性不育性状的雄性不育玉米植 物是BE4207,且其中所述具有响应C型细胞质雄性不育性状的雄性不育恢复系玉米植物是 XJH58。
[0049] 15.依照项11的方法，其中所述Rf4基因是螺旋-环-螺旋转录因子 GRMZM2G021276(Rf4-bHLH)。
[0050] 16.依照项11的方法，其中所述多个F2玉米植物包含至少500个玉米植物。
[0051] 17.依照项11的方法，其中所述多个F3玉米植物包含至少5000个玉米植物。
[0052] 18. -种在