一种经微生物发酵定向转化制备表儿茶素（ec）单体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品技术领域，具体涉及一种微生物发酵工程定向转化与反相填料柱色谱工艺联用从绿茶提取物中分离纯化表儿茶素【(-)-Epicatechin，EC] (CAS:490-46-0)单体的方法。
【背景技术】
[0002]儿茶素类化合物是茶叶保健功能的主要成分，国内外大量研究报道儿茶素具有清除体内自由基、抗氧化、预防心脑血管疾病、抑制肿瘤生长和抗病毒、防辐射等显著生理药理活性，广泛应用于食品饮料和日用化工领域[1 3] O 2006年10月，美国FDA正式批准以EGCG为主要成分的植物药Veregen(NDA编号:N0.21902)用于外生殖器疣和肛周疣的皮肤治疗，成为1962年美国药品修正案条例来首个批准上市的植物(草本)处方药物，在世界植物药领域引发巨大反响，也极大地推进了茶叶提取物产业的发展，儿茶素其他各单体组分的分离纯化、活性研究与临床应用也迅速成为茶学学科研究与产业开发的新焦点[4 7]。
[0003]表儿茶素【(_)-Epicatechin，EC](CAS: 490-46-0)同样具有降脂减肥、预防心脑血管疾病、防癌抗突变等多种生理活性功效，与其他儿茶素类成分相比较，尤其能够显著提高中老年受试对象的空间记忆与认知功能，从而引起了国内外学者的极大兴趣，但由于其在绿茶原料中含量远远低于EGCG，且与ECG、EGC和D，L-C等化学成分结构相似，精细分离技术难度极高，迄今尚未有高纯度EC单体的产业化制备工艺面世12]。本发明以绿茶提取物(85%多酚)为原料，筛选合适的微生物品种进行发酵定向转化，首先将原料中的ECG (表儿茶素没食子酸酯)定向转化为EC，使其在绿茶提取物中的含量提高3-4倍，再通过反相填料柱色谱分离纯化，反渗透膜浓缩，低温结晶，最终冷冻干燥得到98%EC单体。本发明工艺在三个方面(定向发酵增加底物中EC浓度、消除底物中ECG分离干扰，反相柱色谱分离)同时着手，从根本上突破了高纯EC单体产业化制备的技术瓶颈，EC收率显著提高，适用于规模化工业生产。
[0004]参考文献如下:
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【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是从绿茶提取物中分离纯化表儿茶素(EC，纯度多98%)单体，优化了产品分离纯化工艺流程，显著提高了产品得率，产品可单独或复配应用于食品、饮料、日用化工和药品领域，本发明方法简便，制备周期短，成本低，符合环保和安全的要求，适宜大规模工业化生产。
[0006]本发明方法联用生物发酵工程，反相聚合物填料层析柱色谱与反渗透膜浓缩技术，
本发明提供的技术方案是:一种经微生物发酵定向转化制备表儿茶素(EC)单体的方法，主要包括如下步骤:
(I )利用微生物液体深层发酵将绿茶提取物中的表儿茶素没食子酸酯(ECG)转化为表没食子儿茶素(EC):
加入纯水溶解绿茶提取物茶多酚，配置成浓度为1% (w/V)的溶液，调节pH=6.0，料液经高温瞬时灭菌后，注入发酵罐，保持温度32±1°C并接种菌株，，搅拌发酵培养60-80个小时；发酵液经高温瞬时灭活后，离心过滤，取澄清液浓缩至20% (w/v)浓度后，喷雾干燥，产品即为表儿茶素(EC)粗品；
(2 )将上述表儿茶素(EC)粗品经反相填料层析色谱分离纯化:
加入纯水溶解EC粗品配置成浓度为10% (w/v)的上柱料液，反相聚合物填料柱层析分离纯化，反渗透膜浓缩解吸馏分，喷雾干燥得到高含量表儿茶素(EC >90%)产品；
(3 )将上述高含量表儿茶素(EC >90%)产品用5~6倍量(w/v) 20%乙醇溶解，4°C放置结晶，待晶体充分生长，脱除母液，4°C冷水洗涤晶体至洗涤液无色，将得到的晶体冷冻干燥，得白色或类白色固体，即为表J L茶素(EC)单体(>98%) ο
[0007]所述的方法，步骤(I )中，所述菌株为黄曲霉Cr-1菌株，米曲霉(Asp.0ryzae)，红曲属(Monascus)，黑曲霉(Aspergillus niger)，鲁氏毛霉(Mucor rouxii)，安氏红曲霉(Monascus.anka)中一种。
[0008]所述的方法，步骤(I )中，