(1)斜面培养：将菌株MQ0-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养 温度为30°C，培养时间为24h，此时，菌落大而光滑，无色素积累；
[0038] 斜面培养基：斜面培养基（g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,氯化钠5,琼脂20 ;pH为 7. 0-7. 3 ;优选为7. 2 ;斜面培养基的灭菌温度115°C，灭菌时间15min。
[0039] (2)扩大培养：从步骤（1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀 释后的浓度为3 X 105-5 X IO5个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上置于摇床中进行扩大 培养，接种量为10% (v/v)，扩大培养的温度为30°C，培养时间为18h，摇床振幅为85mm，摇 床频率为〇-18h，摇床转速为100r/min。
[0040] 种子培养基（g/L):葡萄糖30,牛肉膏5,蛋白胨10,氯化钠 15,磷酸二氢钾3,硫酸 镁0. 5,硫酸亚铁0. 05,硫酸锰0. 05, VB1 · HCl 0. 005 ;用氢氧化钠调节pH为7. 0 ;250mL三 角瓶装液量为20mL，1000 mL三角瓶装液量为150mL ;种子培养基灭菌温度为115°C，灭菌时 间为15min。
[0041] (3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10% (v/ v)，接种时菌体溶液的浓度为3 X 105-5 X IO5个/mL，培养条件为：培养温度35°C，培养时间 28 小时，摇床振幅 85mm，0-10h，摇床转速 100r/min，10-20h，摇床转速 120r/min，20-28h，摇 床转速100r/min ;
[0042] 发酵培养基（g/L):葡萄糖3,酵母膏10,牛肉膏5,蛋白胨10,玉米浆5,酵母膏 1，氯化钠 5,磷酸二氢钾3,硫酸镁0. 5, L-精氨酸5,硫酸亚铁0. 05,硫酸锰0. 05, VB1HCl 0. 005 ;用氢氧化钠调节pH为7. 2,灭菌温度121°C，灭菌时间20min。
[0043] (4)30L发酵罐培养：将步骤（3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培 养基中，接种量为10 % (v/v)，控制罐压0. 05MPa，在35°C条件下培养24小时，搅拌转速 600_800rpm，风量I :0. 8m3/m3 · min (vvm)，控制溶氧30-40 %，全程用无菌饱和氨水控制 pH6. 7-7. 0,中途补糖控制残糖为1%，放罐残糖为0%，发酵后得精氨酸脱亚胺酶菌体。
[0044] 实施例3L-精氨酸精经过精氨酸脱亚胺酶的转化制备L-瓜氨酸的方法，具体步骤 如下：
[0045] (1)底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经732氨型树脂吸附，用2. ON氨水洗脱， 得到精氨酸阳柱纯化液；
[0046] (2)转化培养：将含有精氨酸脱亚胺酶的菌体，用生理盐水洗涤1次，离心后收 集菌体。将菌体转移到转化液中，转化液包括0. 45mol/L的醋酸缓冲液和0. 5g/L的CTAB， 加入10%的L-精氨酸纯化液，37°C保温24h，即得L-瓜氨酸转化液。
[0047] 实施例4L-瓜氨酸转化液的分离纯化
[0048] (1)离子交换：将转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用 1.0 N氨水洗脱，洗脱液再过流D335-OH型树脂除去阴离子杂质得到鸟氨酸纯化液，收率达 到 95% ;
[0049] (2)纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤鸟氨酸纯化液得到瓜氨酸纳滤清液，用 3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含瓜氨酸产品的纳滤透 析液，该步骤收率达到98% ;
[0050] (3)调pH、脱色：用盐酸调节瓜氨酸纳滤清液的pH至4. 5,用活性炭进行脱色，活 性炭的用量为瓜氨酸纳滤清液的〇. 5% (质量分数），脱色温度为50°C，脱色时间为30min， 用0. 22 μ m滤膜过滤得脱色液，脱色液透光率多99 %，收率达到99 % ;
[0051] (4)反渗透浓缩：将瓜氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到瓜氨酸脱氨 后的预浓缩液，收率达到99% ;
[0052] (5)浓缩结晶：将预浓缩液在真空度多0. 095,蒸发温度50°C条件下浓缩至浓缩度 含量多80%的浓缩液，将浓缩液放至5°C冰箱保温2h得到瓜氨酸结晶。
[0053] 试验例1本发明中转化条件的确定
[0054] (1)反应温度的确定反应温度对L-瓜氨酸产量的影响，在25°C -42°C范围内的不 同温度下，固定化细胞和游离细胞的转化反应IOh的情况，温度越高瓜氨酸产率越高，37°C 达到最高，超过37°C则产率下降。
[0055] (2)pH的确定pH对L-瓜氨酸产量的影响，配制不同pH条件下的底物溶液（pH4. 0、 5. 0、8. 0)，在37°C下反应10h，考察pH对酶活（产物量）的影响，pH为6. 5时底物浓度最 尚，即相对酶活最尚。
[0056] (3)转速的确定转速对L-瓜氨酸产量的影响，当转速为120r/min时瓜氨酸产量最 大。但是转速对颗粒的强度造成很大的影响，故采用转速为l〇〇r/min。
[0057] (4)底物浓度和反应时间的确定底物浓度和反应时间对L-瓜氨酸产量的影响，随 着L-精氨酸浓度的增大，L-瓜氨酸浓度达到最大所需要的时间逐渐延长。当L-精氨酸浓 度为10%时，固定化细胞转化20h瓜氨酸浓度达到最大，延长时间产物浓度不再增加而趋 于稳定；当L-精氨酸浓度继续增加时，产物L-瓜氨酸的产量不再增加而趋于稳定，此时增 加底物浓度已没有意义，故而选择底物L-精氨酸浓度为10%。
[0058] 试验例2精氨酸摩尔转化率的测定
[0059] 将菌体接种到50mL液体培养基中于30°C培养24h。培养好的发酵液4°C下4000r/ min离心30min，弃去上清液。将菌体转移至IOmL醋酸缓冲液，加入0. 15g精氨酸，在37°C 下转化24h。6000r/min离心10min，测定上清液中的L-瓜氨酸浓度，并计算底物精氨酸的 摩尔转化率y，以此表示精氨酸酶的活力。本发明测得精氨酸摩尔转化率为98. 2%。
[0060] y = nA/nB
[0061] 其中nA为转化液中L-瓜氨酸的物质的量（mol) ;nB为转化液中原始的精氨酸的 物质的量（mol)。
[0062] 试验例3本发明中获得的L-瓜氨酸盐酸盐的检验
[0063] 中试产品经青岛谱尼测试有限公司的第三方检验，各项指标符合美国联邦通讯委 员会，L-瓜氨酸盐酸盐USP标准，主要性能指标见表1所示：
[0064]表 1
【主权项】
1. 一种以精氨酸为原料制备L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经732氨型树脂吸附，用2.ON氨水洗脱，得到 精氨酸阳柱纯化液； (2) 转化培养：将含有精氨酸脱亚胺酶的菌体，用生理盐水洗涤1次，离心后收集菌 体。将菌体转移到转化液中，转化液包括0. 45mol/L的醋酸缓冲液和0. 5g/L的CTAB^PA 10%的L-精氨酸纯化液，37°C保温24h，即得L-瓜氨酸转化液。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脱亚胺酶的制备步骤如下： (1) 斜面培养：将菌株MQO-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度 为30°C，培养时间为24h; (2) 扩大培养：从步骤（1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后 的浓度为3X105-5XIO5个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上，将种子培养基置于摇床 中进行扩大培养，接种量为10% (v/v)，扩大培养的温度为30°C，培养时间为18h，摇床振幅 为85mm，摇床频率为0-18h，摇床转速为lOOr/min; (3) 发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10% (v/v)， 接种时菌体溶液的浓度为3X105-5XIO5个/mL，培养条件为：培养温度30°C，培养时间28 小时，摇床振幅85mm，0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/min，20-28h，摇床 转速 100r/min; (4) 30L发酵罐培养：将步骤（3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基 中，接种量为10% (v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3X105-5XIO5个/mL，控制罐压强为 0. 05MPa，在 30°C条件下培养 24 小时，搅拌转速 600-800rpm，风量I:0. 8m3/m3 ?min(vvm)， 控制溶氧量为30-40%，全程用无菌饱和氨水控制pH6. 7-7. 0,中途补糖控制残糖为1%，放 罐残糖为〇 %，发酵后得精氨酸脱亚胺酶菌体。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中斜面培养基（g/L)为：牛 肉膏5,蛋白胨10,氯化钠5,琼脂20。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中斜面培养基的pH为 7. 0-7. 3;优选的，pH为 7. 2。5. 根据权利要求3或4所述的方法，所述步骤（1)中斜面培养基的灭菌温度为115°C， 灭菌时间为15min。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中种子培养基（g/L)为：葡 萄糖30,牛肉膏5,蛋白胨10,氯化钠15,磷酸二氢钾3,硫酸镁0. 5,硫酸亚铁0. 05,硫酸锰 0. 05,VB1 ?HCl0. 005。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中种子培养基用氢氧化钠调 节pH为7. 0,灭菌温度为115°C，灭菌时间为15min。8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中发酵培养基（g/L)为：葡 萄糖3,酵母膏10,牛肉膏5,蛋白胨10,玉米浆5,酵母膏1，氯化钠5,磷酸二氢钾3,硫酸镁 〇? 5,L-精氨酸 5,硫酸亚铁 0? 05,硫酸锰 0? 05,VB1 ?HCl0? 005。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中发酵培养基用氢氧化钠调 节pH为7. 2,灭菌温度121°C，灭菌时间20min。10. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌株MQO-153的保藏编号为CGMCC
【专利摘要】本发明涉及一种以精氨酸为原料制备L-瓜氨酸的方法，具体步骤为：(1)底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经732氨型树脂吸附，用2.0N氨水洗脱，得到精氨酸阳柱纯化液；(2)转化培养：将含有精氨酸脱亚胺酶的菌体,用生理盐水洗涤1次，离心后收集菌体。将菌体转移到转化液中，转化液包括0.45mol/L的醋酸缓冲液和0.5g/L的CTAB，加入10％的L-精氨酸纯化液，37℃保温24h，即得L-瓜氨酸转化液。本发明采用精氨酸发酵纯化液作为转化原料，克服了精氨酸酶转化法生产瓜氨酸的瓶颈，价格低廉易得，工艺简单，产品纯度高。CGMCC No.1072620150421
【IPC分类】C12P13/10, C12R1/46, C12N9/78
【公开号】CN105177075
【申请号】
【发明人】高法民, 王威, 闫洪波
【申请人】滨州市生物技术研究院有限责任公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月1日