一种生物转化法合成α-酮戊二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体地说，是关于一种生物转化法合成α -酮戊 二酸的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] α -酮戊二酸（a -ketoglutaric acid)，又名α -羰基戊二酸、2-氧代戊二酸或 α -胶酮酸，CAS号为328-50-7。α -酮戊二酸是三羧酸（TCA)循环中重要的中间产物之 一，在细胞物质代谢和能量代谢中起着重要的作用。它作为重要的中间体，是合成多种氨基 酸、维生素的重要前体。α -酮戊二酸在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应 用前景，目前其主要应用的领域有：作为运动功能饮料的成分、有机合成中的中间体、肝功 能检测的配套试剂和体格增强剂；降低术后患者和长期病人的机体损耗；还有研究表明， α-酮戊二酸具有抗氰作用，与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，具有抗惊 厥作用。
[0003]目前α -酮戊二酸的生产工艺主要是化学合成法。化学合成法以琥珀酸和草酸二 乙酯为原料经化学反应制备，由于成本过高、污染严重而面临被淘汰。α -酮戊二酸的生产 也可以采用生物发酵法或生物转化法，相对于化学合成法，生物法具有生产条件温和、工艺 步骤简单、对环境友好等优点。近些年来，生物法合成α-酮戊二酸的研究取得了很大进 展，发酵单位或转化率有大幅度提高，但生产成本仍高于化学合成法，工业化应用尚有一定 困难。
[0004] 近几年来国内关于生物法合成α-酮戊二酸有较多研究报道，并申请了一些 专利。如江南大学的陈坚等人利用重组解脂耶氏酵母菌（Yarrowia Iipolytica)发 酵生产α-酮戊二酸，发酵144h，α-酮戊二酸的产量达到47. 2g/L(中国发明专利 ZL201210066444. 6);天津科技大学的陈宁等人利用对谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)发酵生产α -酮戊二酸，发酵32h，α -酮戊二酸产量最高可达47. 2g/L (中国 发明专利ZL201110392778. 8)。但是，发酵法也有其缺点，如生产周期长，产品与发酵液中 多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本偏高。而生物转化法或许能克服发 酵法的缺陷，可以提高产品浓度、简化提取工艺、降低成本。如陶荣盛等人采用L-谷氨酸氧 化酶对L-谷氨酸或其盐进行生物转化，生成α -酮戊二酸的浓度可高达138. 5g/L，摩尔得 率达80%以上（中国发明专利申请号201310134674. 6)。但该发明需要制备L-谷氨酸氧 化酶，而且在催化反应时需要添加商品过氧化氢酶，所以生产中酶的成本较高。江南大学 的陈坚等人还报道了一种采用全细胞转化L-谷氨酸生产α -酮戊二酸的方法，通过易错 PCR或定点饱和突变改造 L-氨基酸脱氨酶基因，在枯草芽孢杆菌表达后转化L-谷氨酸生成 α -酮戊二酸，摩尔得率可达85%以上，但底物浓度仅为15g/L，产量有待提高。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种利用马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus) ATCC36534全细胞生物转化L-谷氨酸合成α -酮戊二酸的方法，以酵母细胞为生物催化剂， L-谷氨酸为原料，全细胞法生物转化合成α -酮戊二酸。在高糖低氮培养基中，添加脱氢酶 抑制剂，阻止α-酮戊二酸被进一步代谢，从而促进α-酮戊二酸的积累，如此就可以将廉 价的L-谷氨酸转化为价格更高的α -酮戊二酸，解决了目前发酵法、酶法和全细胞转化法 生产成本较高的问题，具有较高的工业化应用价值。
[0006] 本发明全细胞法生物转化合成α -酮戊二酸反应式：
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种生物转化法合成α -酮戊二酸的方法，所述方法以L-谷氨酸为底 物，于马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)ATCC36534经转化培养基培养获得 的转化培养液中，加入α -酮戊二酸脱氢酶抑制剂，在25~30°C、200~250r/min振荡条 件下进行合成培养，合成培养结束后，合成培养液经分离纯化得到所述的α -酮戊二酸；所 述α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂为过氧化氢（H2O2)或甲氨蝶呤中的一种或两种的混合；所述 转化培养基的组成为（试剂均为市售分析纯或生物试剂）：蔗糖50~100g/L，酵母浸出粉 10 ~20g/L，KH2P04 3 ~5g/L，K2HP04 5 ~6. 5g/L，MgS04 0· 5 ~1.0 g/L，溶剂为水，pH 值自 然。
[0010] 进一步，所述的底物在转化培养液中的添加量为20~50g/L。所述的底物L-谷氨 酸（CAS:56-86-0)为市售原料，纯度彡98%。
[0011] 进一步，所述的α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂添加量以转化培养液体积计为 0. 0005~50mmol/L。所述的α -酮戊二酸脱氢酶抑制剂为H2O2时，所述H 202以质量浓度 30%的H2O2水溶液的形式加入，H2O2水溶液中H 2O2的加入量以转化培养液体积计为10~ 50mmol/L。所述的α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂为甲氨蝶呤时，所述甲氨蝶呤以lmmol/L的 甲氨蝶呤水溶液的形式加入，所述甲氨蝶呤水溶液中甲氨蝶呤加入量以转化培养液体积计 为0. 5~I ymol/L。所述的α -酮戊二酸脱氢酶抑制剂为H2O2和甲氨蝶呤的混合时，所述 H2O2以质量浓度30%的H2O2水溶液的形式加入，H 2O2水溶液中H2O2的加入量以转化培养液 体积计为40mmol/L，所述甲氨蝶呤以lmmol/L的甲氨蝶呤水溶液的形式加入，所述甲氨蝶 呤水溶液中甲氨蝶呤加入量以转化培养液体积计为〇. 8 μ mol/L。所述的α -酮戊二酸脱氢 酶抑制剂的作用是抑制α-酮戊二酸脱氢酶的活性，阻断α-酮戊二酸进一步的代谢，从而 α-酮戊二酸得以积累。
[0012] 本发明所述马克斯克鲁维酵母ATCC36534以干菌体浓度6~10g/L的转化液形式 与底物进行转化反应，所述转化液是将马克斯克鲁维酵母ATCC36534斜面菌体接种至转化 培养基或将干菌体浓度5~7g/L的种子液以体积百分数5-10 %的接种量接种至转化培养 基经转化培养获得的。
[0013] 具体的，本发明所述生物转化法合成α -酮戊二酸的步骤如下：
[0014] (1)将冰箱保存的马克斯克鲁维酵母ATCC36534的菌体接种于新鲜斜面培养基， 于25~30°C恒温培养箱中培养24~36h，得到活化后的马克斯克鲁维酵母ATCC36534菌 种。所述的斜面培养基组成为：葡萄糖10~20g/L，蛋白胨5~10g/L，酵母浸出粉3~5g/ L，琼脂15~20g/L，溶剂为水，pH自然（实测6. 3~6. 5)，高压蒸汽121°C灭菌15~20min。
[0015] (2)用接种环挑取步骤（1)活化培养后马克斯克鲁维酵母ATCC36534斜面菌体 2~3环，接种至种子培养基。接种后的种子培养基于25~30°C、200~250r/min振荡条 件下培养20~24h，得干菌体浓度为5~7g/L的种子液。所述的种子培养基组成除不加琼 脂外，其他成分同步骤（1)中的斜面培养基，在三角瓶中的装量为其容积的20%~40%，三 角瓶8层扎口，高压蒸汽121°C灭菌15~20min。
[0016] (3)用接种环挑取步骤（1)活化培养后马克斯克鲁维酵母ATCC36534斜面菌体 3~5环，或步骤（2)制备的种子液，按体积百分数5%~10%的量接入转化培养基，于25~ 30°C、200~250r/min振荡条件下培养20~24h，获得干菌体浓度为6~10g/L，加入终浓 度为10~50mmol/L的H2O2，或终浓度为0. 5~I. 0 ymol/L的甲氨蝶呤，或两者同时添加； 再加入终浓度为20~50g/L的L-谷氨酸。三角瓶在