r>[0047] 3.1 PCR引物设计与合成
[0048] 参考E2F启动子（E2Fp)序列（GenBank :S74230)设计引物，上游引物（SEQ ID No. 1所示序列）：
[0049] 5，-GTTTCATCCGGACAAAGCC-3，，
[0050] 下游引物（SEQ ID No. 2所示序列）：
[0051] 5' -CTCGAGGATATCATCGAG-3'。根据人 IL15 基因序列（GenBank :HSU14407)设计 引物，上游引物（SEQ ID No. 3所不序列）：
[0052] 5' -ACGCGTCGACTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTG-3'，
[0053] 下游引物彼〇10如.4所示序列）：
[0054] 5' -CCGGAATTCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATT-3'。
[0055] 以质粒hIL2SPIL15 (包含IL2信号肽基因）为模板进行PCR扩增。反应循环参数 为：94°C预变性5min ;94°C变性40sec，56°C退火40sec，68°C延伸90sec，共30个循环；最 后68°C延伸lOmin。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0056] 3. 2 质粒 PXC20-E2Fp 的构建
[0057] 内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒P55-E2Fp (购于上海白泽生物科技有限公司，包 含E2F-1启动子-218~+51，具体结构见图1)，胶回收1088bp的DNA片段（表1);内切酶 EcoRI和XhoI双酶切质粒PXC20,胶回收8965bp的DNA片段（表2)。二者按载体连接试 剂盒说明连接12h后（表3)，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，铺含AMP的琼脂 板后，于37°C生化培养箱内培养10_12h。挑取生长的细菌单克隆，于含氨苄青霉素的LB溶 液中，37°C摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为PXC20-E2Fp。 PXC20-E2Fp的构建流程示意图如图1所示，酶切鉴定结果如图2所示。
[0058] 表1质粒P55-E2Fp的酶切回收
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[0065] 3· 3 质粒 pENTER12-IL2SP-IL15 的构建
[0066] 内切酶EcoRI和Sail双酶切质粒hIL2SPIL15的PCR扩增产物PCR-hIL2SPIL15(表 4)，胶回收477bp的DNA片段，内切酶EcoRI和Sail双酶切质粒pENTER12(表5)，胶回收 3002bp的DNA片段。二者按载体连接试剂盒说明连接12h后（表6)，将连接产物转化大肠 杆菌感受态细胞DH5 α，铺含AMP的琼脂板后，于37°C生化培养箱内培养10_12h。挑取生 长的细菌单克隆，于含氨苄青霉素的LB溶液中，37°C摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒 DNA，酶切鉴定正确后命名为pENTER12-IL2SP-IL15。pENTER12-IL2SP-IL15的构建流程示 意图如图3所示。
[0067] 表 4 PCR_hIL2SPIL15 的酶切回收
[0074] 3. 4 PPE3-IL2SP-IL15 的构建
[0075] 质粒pPE3-RC 与 pENTER12-IL2SP-IL15 进行 LR重组反应。25°C水浴 6h 后，加 1 μ 1 蛋白酶Κ，37°C水浴IOmin。转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，铺含AMP的琼脂板后，于37°C 生化培养箱内培养l〇_12h。挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青霉素的LB溶液中，37°C摇 床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为PPE3-IL2SP-IL15。LR重组 反应如图4所示。
[0076] 质粒pENTER12-IL2SP-IL15和PPE3-IL2SP-IL15的酶切鉴定结果如图5所示。
[0077] 3. 5重组及鉴定
[0078] 将质粒 PXC20-E2Fp 与 PPE3-IL2SP-IL15 通过 Lipofectamine2000 共转染至 HEK293细胞。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，用PCR进行鉴定。经鉴定正确的重组腺病毒命名为 Ad-E2FI/1L15。HEK293细胞内重组示意图如图6所示，溶瘤腺病毒Ad-E2FI/1L15的PCR鉴 定结果如图7所不。
[0079] 3. 5. I HEK293细胞的培养流程图如图13所示。
[0080] 3. 5. 2病毒的扩增流程图如图14所示。
[0081] 3. 5. 3 50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度流程图如图15所示。
[0082] 重组腺病毒Ad-E2F1/IL15的DNA结构示意图如图8所示，构建总流程图如图9所 不。
[0083] 实施例2重组溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15对细胞增殖的影响实验
[0084] 将人结肠癌细胞SW620和人胚肺成纤维细胞Wi38以每孔5000个的量铺入96孔 板，培养6h (细胞贴壁）后加入感染系数（MOI)为10PFU/细胞的Ad-E2F1/IL15病毒（实 施例1中制备）及不含IL15基因的溶瘤病毒Ad-E2F1，每组3个平行孔，病毒作用2h后弃 去含病毒的培养液，换成IOOyL 5%胎牛血清的培养液继续培养。第0、1、3、5、7天取相应 的96孔板，加入MTT液体（每孔30 μ L)，37°C孵育4小时，用移液器小心吸弃孔内培养上清 液，加入二甲基亚砜溶液150 μ L，振荡器震荡20min，使结晶物充分融解，选择492nm波长， 在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。
[0085] 细胞体外增殖实验结果显示，溶瘤腺病毒Ad-E2F1和Ad-E2F1/IL15均能明显抑制 人结肠癌SW620细胞的增殖，第7天时抑制率均达70%以上，而对人正常细胞系Wi38的增 殖无明显影响（图10)，说明重组腺病毒能够选择性杀伤高增殖细胞，实现了其肿瘤特异性 杀伤作用。
[0086] 实施例3重组溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15感染细胞后ELISA法检测IL-15的表达 量
[0087] 取对数生长期的人结肠癌细胞SW620和人胚肺成纤维细胞Wi38,分别接种至6孔 板中（IX IO5AiL)培养24h，以MOI为5PFU/细胞加入病毒Ad-E2F1/IL15(实施例1中制 备），2h后换成100 μ L 5%胎牛血清的培养液继续培养，收集感染12、24、48h的细胞培养上 清，用ELISA法检测IL-15的表达量。
[0088] Ad-E2F1/IL15感染48h后，SW620细胞培养上清中的IL-15含量明显增加，而Wi38 细胞细胞上清中的IL-15始终维持在较低水平（图11)。说明Ad-E2F1/IL15在选择性裂 解肿瘤细胞SW620的同时IL-15表达显著增高，符合免疫增强型溶瘤病毒的构建要求。
[0089] 实施例4重组溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15对肿瘤生长的抑制实验
[0090] 在BALB/c裸鼠（雄性，6周龄）右侧腋下皮下注射人结肠癌细胞SW620 (I X /IO6/ 只），构建皮下瘤动物模型。肿瘤长至40-50_3时，将小鼠随机分为4组，分别进行 PBS (100 μ I)、Ad-EGFP (只表达绿色荧光的5型腺病毒作为对照病毒）或Ad-E2F1或 Ad-E2F1/IL15(5X 10SPFU/100 μ 1)瘤内注射治疗，隔天进行1次，共3次。每3天观察并记 录肿瘤生长情况，按照"肿瘤体积=(短径2X长径）/2"公式计算肿瘤体积。于第24天， Ad-E2F1/IL15治疗组肿瘤生长被显著抑制，治疗效果显著优于其他治疗组（PBS&Ad-E2Fl/ IL15, p = 0. 0002 ;Ad-EGFP&Ad-E2Fl/IL15, p = 0. 0008 ;Ad-E2Fl&Ad-E2Fl/IL15, p = 0· 0054) 〇 (图 12)
[0091] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其是将5型腺病毒El区基因 启动子替换成转录因子E2F-1基因，且在E3区插入hIL-15基因而构建得到的重组溶瘤腺 病毒。2. 权利要求1所述重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 质粒PXC20-E2Fp的构建：用EcoRI和XhoI双酶切质粒P55-E2Fp，回收大小为 1088bp的DNA片段，同时用EcoRI和XhoI双酶切质粒PXC20,回收大小为8965bp的DNA片 段，将上述两个回收的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂布于含 AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正 确后命名为PXC20-E2Fp; 2) 质粒pENTER12-IL2SP-IL15的构建：根据hIL-15基因序列设计PCR扩增引物， 上游引物： 5' -ACGCGTCGACTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTG-3'， 下游引物： 5' -CCGGAATTCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATT-3'， 以质粒hIL2SPIL15为模板，进行PCR扩增，扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定正确 后，用EcoRI和Sail双酶切扩增产物，回收大小为477bp的DNA片段；再用EcoRI和Sail 双酶切质粒PENTER12,回收大小为3002bp的DNA片段，将上述两个回收的DNA片段连接，连 接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB 液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为PENTER12-IL2SP-IL15 ; 3) 质粒PPE3-IL2SP-IL15 的构建：质粒pPE3-RC与pENTER12-IL2SP-IL15 进行LR重 组反应，所得产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于 含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为PPE3-IL2SP-IL15 ; 4) 重组溶瘤腺病毒的制备：将质粒PXC20-E2Fp与PPE3-IL2SP-IL15共转染至HEK293 细胞，转染后9-14天出现病毒空斑，经过病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定。经 鉴定正确的重组腺病毒命名为Ad-E2F1/IL15。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行PCR扩增hIL-15基因的反 应条件为：94°C5min;94°C40sec，56°C40sec，68°C90sec，共 30 个循环；68°CIOmin04. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中质粒PXC20-E2Fp与 PPE3-IL2SP-IL15 通过Lipofectamine2000 共转染至HEK293 细胞。5. 权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒或权利要求2-4所述的方法在制备抑制肿瘤生长 的药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种表达人白介素15的新型重组溶瘤腺病毒，其是将5型腺病毒E1区基因启动子替换成转录因子E2F-1基因，且在E3区插入hIL-15基因而构建得到的重组溶瘤腺病毒。本发明以E2F-1作为启动子实现病毒特异性在肿瘤细胞内复制的同时，在病毒基因E3区载人IL-15基因可以进一步提高病毒抗肿瘤作用：由于pRb/E2F通路缺陷广泛存在于实体肿瘤中，通过病毒的溶瘤作用，可获得丰富的各种来自于个体自身的肿瘤抗原，且不受抗原亚细胞定位的局限性，有利于产生具有自身肿瘤特异性的抗肿瘤免疫应答，具有个性化和普遍性的治疗意义；另外，病毒复制过程中带动IL-15基因表达，在病毒感染的肿瘤细胞局部获得高浓度IL-15，有利于刺激免疫细胞的活性，激活全身免疫反应，增强抗肿瘤效果。
【IPC分类】C12N15/861, C12N15/24, A61P35/00, A61K38/20, A61K48/00
【公开号】CN105177045
【申请号】
【发明人】晏阳, 杜晓辉, 徐迎新, 李 荣
【申请人】晏阳
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年5月21日