表 2
[0139] CN 105177044 A 说明书 10/11 页
[0141] 基因型测序验证6头出生的克隆猪的碱基系列都与所用供体细胞12号的碱基系 列是一致的，都以缺失24个碱基的方式敲除。
[0142] 3.我们取野生型滇南小耳猪成纤维细胞、克隆滇南小耳猪成纤维细胞以及P53基 因敲除克隆猪成纤维细胞样品通过强力霉素诱导后进行细胞免疫荧光验证对比发现，只有 在敲除P53基因克隆猪的成纤维细胞未出现细胞免疫荧光，说明P53基因在细胞中均已无 表达。
[0143] 4.通过组织免疫学以及免疫组化染色的方法，在小型猪的各组织器官中均出现淋 巴瘤。
[0144] 通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型，与利用其他诱导方法建立的动物 疾病模型相比，本模型的建立操作简单、实用性强、可控性高、复制性好，可以从根本上阐明 和研究淋巴瘤的致病机理和遗传机制，为淋巴瘤的"治本"药物研究指明了研究方向；再者， 小型猪与小鼠、大鼠、兔等动物相比，小型猪的体型、血液循环量更大，有利于胚胎移植中的 手术操作，而且在体重、生理结构上与人极为相似，建立相应的疾病模型指标与人的疾病临 床指标更为相近，这为在不同水平上来探讨人类疾病的致病机制以及遗传因素提供了依 据，更利于在人类医学研究中复制和应用。
[0145] 本发明对具体参数的限定，在这个参数选择下，通过敲除P53基因获得淋巴瘤小 型猪动物疾病模型的方法，不仅能够使得模型的建立周期较短，而且小型猪更易观察淋巴 瘤的发生和发展过程。
[0146] 综上所述，小型猪作为人类的食用动物用于转基因实验动物的疾病研究，也符合 伦理要求，而且成本低，价格便宜，不易给实验者造成伤害，通过敲除P53基因获得淋巴瘤 小型猪疾病模型对于人类淋巴瘤的研究和治疗具有重要的参考价值，在未来的医学领域中 易于推广使用。
[0147] 以上对本发明实施例所提供的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的 方法进行了详细介绍，本发明应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以 上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般 技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综上所述， 本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1.通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，其特征在于：所述的通过敲 除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法具体步骤为： 第一步、P53基因敲除TALEN质粒对的设计、组装及胞外活性检测 1) 根据NCBI上猪P53基因序列在第四外显子区域设计TALEN靶点； 2) 组装TALEN质粒pCAG-pP53-L和pCAG-pP53-R，针对左边TALEN识别序 列：TCTGGAACAGCCAAGT，RVD序列如下：NGHDNGNNNNNINIHDNINNHDHDNININN NG;针对右边TALEN识别序列：CCCTCAAGGCCACTGAC，RVD序列如下：HDHDHDNGHDNINI NNNNHDHDNIHDNGNNNIHD，根据左右RVD序列分别对应组装成质粒pCAG-pP53-L和 pCAG-pP53-R； 3. TALEN质粒对的胞外活性检测，一个终止子在luciferase的编码区中央， Iuciferase没有活性，为检测TALEN剪切活性，将一个TALEN的靶点位置序列插在终止子 后，在TALEN的作用下，靶点位置产生DSB，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活 性的Iuciferase;通过与参照的比值变化反应TALEN剪切的活性水平； 4) 将获得的有活性的质粒pCAG-pP53-L和pCAG-pP53-R去内毒素质粒大提，-20°C保 存备用； 第二步、细胞转染、筛选及P53阳性细胞系的获得 1) 转染前3天复苏滇南小耳猪原代胎儿成纤维细胞，利用胰酶消化贴壁细胞，离心 收集细胞，收集细胞数为7XIO5个，利用电击缓冲液进行悬浮，同时加入pCAG-pP53-L和 pCAG-pP53-R质粒，调节使最终体积为700ul，再将混合液放入到0. 4cm的电击杯中，选择方 波，在电压250V，25ms条件下进行1次脉冲电击，将电击后的细胞悬浮液转移到IOOmm培养 皿中，加入DMEM，继续培养； 2) 转染48小时后，利用胰酶消化转染后贴壁的细胞，采用极度稀释培养法培养，最终 稀释为IOOul悬液中细胞的数目为95-105个，稀释培养10-13天细胞即可长成所需的单细 胞克隆； 3) 提取各细胞克隆DNA为模板，使用特异性引物进行扩增，将PCR产物通过T7E1酶切 和测序的方法，以确定各细胞克隆P53基因敲除情况，鉴定为双敲的细胞克隆继续培养及 冻存，留作体细胞核移植备用； 第三步、体细胞核移植及胚胎移植 1) 卵母细胞的成熟培养 a、 从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室； b、 挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0.lmg.ml1丙 酮酸、〇.lmg.ml1L-半胱氨酸盐酸、10 %猪卵泡液、IOng.mL1EGF的TCM-199成熟培养液滴 中，在5%C02,38. 5°C的培养箱中培养38-42h; 2) 构建敲除P53基因的重构胚 a、 取敲除P53基因的成纤维细胞，用含有0. 5%FBS的DMEM培养48h，使体细胞处于G。 b、 卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细 胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理〇. 5-lh，在操作液中用显微注射针将 极体及其周围胞质一起吸去，然后将敲除P53基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞 的卵间隙中； 3) 电融合和电激活重构胚 再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，在25V/mm脉冲电压，脉冲时程为 20ys的电融合参数下进行1次脉冲重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基中培 养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后在150V/mm脉冲电压，脉冲时 程为100ys的参数下进行1次电激活，重构胚移入含有2. 2ug.mL1CB的培养液中后放入含 有5%C02、5% 02、38. 5°C的三气培养箱中平衡2h; 4) 体外培养 将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养48h和7d后分 别观察记录重构胚胎的卵裂率，并用H〇echst33342对囊胚染色，测定囊胚的细胞数； 5) 选取自然发情的代孕母猪进行胚胎移植，将重构胚移植到其体内继续发育，待代孕 母猪妊娠约114天后分娩获得敲除P53基因的克隆仔猪； 第四步、克隆猪P53基因敲除的验证 仔猪出生后用手术剪刀剪取0. 5X0. 5cm的耳组织，按照TissueDNAKit的OMEGA，D3396-02步骤提取各仔猪DNA，使用特异性引物扩增靶点序列，通过T7E1酶切、测序以判断 各仔猪P53基因是否敲除； 第五步、敲除P53基因克隆仔猪组织、器官中淋巴瘤的鉴定 采用组织免疫学以及免疫组化染色的方法，鉴定小型猪中各组织器官中淋巴瘤的发生 以及形成情况。2. 根据权利1所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，其特征在 于：在第一步1)中靶点序列为： TCTGGAACAGCCAAGTCTGTAACCTGCACGGTCAGTGGCCTTGAGGGo3. 根据权利1所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，其特征在 于：在第二步 1)中，加入pCAG-pP53-L和pCAG-pP53-R质粒各 10. 5ug。4. 根据权利1所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，其特征在 于：在第二步1)中，加入的DMEM为IOml含10%FBS的DMEM。5. 根据权利1所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，其特征在 于：在第三步2)b中，所用1透明质酸浓度为0.lmg.mL、6. 根据权利1所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，其特征在 于：在第三步4)中，所用Hoechst33342的浓度为5yg.mL1。
【专利摘要】本发明涉及通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，属于医学动物疾病模型领域；本方法主要包括P53基因TALEN靶点的设计，P53基因敲除TALEN质粒pCAG-pP53-L和pCAG-pP53-R的组装，TALEN质粒的转染，筛选并获得P53基因敲除阳性细胞系，利用体细胞核移植技术构建重构胚，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育后获得敲除P53基因仔猪，通过检测克隆仔猪组织中P53基因及其下游相关基因的RNA及蛋白质表达水平来验证P53基因的功能，采用组织病理学及免疫组化法鉴定仔猪组织中的淋巴瘤；该淋巴瘤疾病模型的建立对开展人类淋巴瘤的发生、形成以及药物的研发具有重要的意义，为人类淋巴瘤疾病的研究和治疗提供了可靠的模型。
【IPC分类】C12N15/85, A61D19/04, C12N5/073, C12N15/873, A01K67/027
【公开号】CN105177044
【申请号】
【发明人】魏红江, 赵红业, 申友锋, 李鸿辉, 赵恒 , 角德灵
【申请人】魏红江, 赵红业
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月29日